Detección combinada de agentes biológicos.

Un método para detectar al menos un primer y un segundo agentes biológicos, comprendiendo el primer agente un primer y un segundo marcadores, y comprendiendo el segundo agente un tercer y un cuarto marcadores, comprendiendo el método:

(a) preparar una primera y una segunda mezclas a partir de al menos una y la misma muestra que se sospecha que contiene los agentes;

(b) detectar la presencia o la ausencia del primer y del tercer marcadores en la primera mezcla en un primer recipiente; y

(c) detectar la presencia o la ausencia del segundo y del cuarto marcadores en la segunda mezcla en un segundo recipiente;

mediante lo cual la presencia del primer y del segundo marcadores indica la presencia del primer agente biológico en la muestra, y la presencia del tercer y del cuarto marcadores indica la presencia del segundo agente biológico en la muestra, en donde:

la primera mezcla comprende una primera sonda que reconoce específicamente el primer marcador y una tercera sonda que reconoce específicamente el tercer marcador;

la segunda mezcla comprende una segunda sonda que reconoce específicamente el segundo marcador y una cuarta sonda que reconoce específicamente el cuarto marcador;

cada una de las sondas tiene un marcador detectable, el marcador detectable de la primera sonda es igual que el marcador detectable de la segunda sonda, y el marcador detectable de la tercera sonda es diferente del marcador detectable de la cuarta sonda;

la etapa de detección (b) comprende determinar la presencia o la ausencia de la primera y de la tercera sondas que se unen al primer y al tercer marcadores en la primera mezcla;

la etapa de detección (c) comprende determinar la presencia o la ausencia de la segunda y de la cuarta sondas que se unen al segundo y al cuarto marcadores en la segunda mezcla.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2005/016257.

Solicitante: CEPHEID.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 904 CARIBBEAN DRIVE SUNNYVALE, CA 94089 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: MCMILLAN, WILLIAM, A..

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/68 (en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos)

PDF original: ES-2527426_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Detección combinada de agentes biológicos Antecedentes de la invención Campo de la invención

La invención se refiere a métodos, y sistemas para la detección de una pluralidad de agentes biológicos en una muestra utilizando una cantidad mínima de recipientes, útiles para ensayos de diagnóstico y búsqueda de agentes de enfermedad.

Descripción de la técnica relacionada

Los ensayos de diagnóstico que detectan de forma sensible, especifica y rápidamente agentes biológicos, por ejemplo, patógenos, en muestras están llegando a ser cada vez más importantes tanto para el control de bioagentes de enfermedad como de diagnóstico. Están disponibles pocos ensayos para detectar de forma precisa organismos fisiológica y clínicamente relevantes en una escala de tiempo apropiada para una detección temprana de la presencia de un agente infeccioso o dañino de otro modo. Hasta la fecha, los métodos de detección más sensibles implican PCR. La determinación de la presencia o ausencia de una pluralidad de agentes biológicos en una única muestra puede realizarse usando métodos de detección combinada. La PCR en tiempo real combinada es un método que puede usarse para este tipo de ensayo de diagnóstico.

Los ensayos basados en PCR pueden estar limitados por la complejidad de optimización de las reacciones de PCR para ensayar múltiples agentes en una cantidad rentable de tubos de reacción. Como norma general, la cantidad de sondas necesarias para apoyar un resultado de confirmación altamente específico varía de dos a tanto como seis secuencias. Un especialista en la técnica sabrá que optimizar una reacción de PCR con muchos pares de cebadores diferentes y sondas puede ser una tarea formidable que llega a ser cada vez más inimaginable según aumenta la cantidad de agentes a detectar.

Los ensayos basados en PCR también pueden estar limitados por la cantidad de marcadores químicos únicos disponibles para análisis de resultados. Por ejemplo, los ensayos de PCR en tiempo real generalmente emplean marcadores fluorescentes. Cuando se realiza PCR en tiempo real combinada, la cantidad de marcadores que puede usarse en una única reacción está limitada por la cantidad de canales de color fluorescente disponibles en el sistema de detección óptica usado.

El documento US 23/124545 A1 (ROTHMAN RICHARD ERIC [US] ET AL) describe un método para detectar al menos dos agentes biológicos, comprendiendo cada agente al menos dos marcadores. El método comprende preparar una única mezcla a partir de una muestra que se sospecha que contiene dichos agentes, detectar la presencia de uno de los marcadores a partir de cada agente (las regiones de unión del cebador de PCR) y detectar la presencia del otro marcador a partir de cada agente (las regiones de unión a la sonda), de modo que la presencia de ambos marcadores indique la presencia de un agente dado.

El documento EP-A-1 288 38 (ROCHE DIAGNOSTICS GMBH [DE]; HOFFMANN LA ROCHE [CH]) propone una solución diferente al problema de detección homogénea de múltiples productos en una muestra usando más sondas que marcadores diferentes. Algunos productos se detectan por una única sonda marcada, mientras que otros se detectan por una sonda mixta en que alguna cantidad de la sonda está acoplada a un marcador, y el resto está acoplado a un marcador diferente. Los productos se distinguen por la proporción entre las diferentes señales. Se usa en ensayos TaqMan para detectar productos de PCR de 6 virus en un único tubo.

Un enfoque atractivo para superar estas y otras limitaciones de los actuales ensayos combinados se proporciona por la presente invención.

Sumario de la invención

En este documento se describen métodos para la detección combinada eficaz, rentable y específica de múltiples agentes biológicos en una muestra, por ejemplo, detección combinada de agentes biológicos; por ejemplo, bacterias, virus, toxinas biológicas, y similares. El método utiliza dos marcadores para cada agente; la presencia o ausencia de cada uno de los dos marcadores por agentes se determina en recipientes separados. Cada recipiente se usa para detectar un único marcador para múltiples agentes. Si no se detectan marcadores para ningún agente en el primer recipiente, no tiene que utilizarse el segundo recipiente, ahorrando tiempo y dinero significativos. En una realización preferida, se usa PCR en tiempo real fluorescente combinada para determinar la presencia o ausencia de hasta nueve agentes biológicos diferentes en una muestra usando solamente dos series de reacciones. También se describen kits y sistemas que emplean el método.

De acuerdo con un aspecto, la invención proporciona

un método para detectar al menos un primer y segundo agente biológico, comprendiendo el primer agente un primer y segundo marcador, y comprendiendo el segundo agente un tercer y cuarto marcador, comprendiendo el método:

(a) preparar una primera y segunda mezcla a partir de al menos una y la misma muestra que se sospecha que contiene los agentes:

(b) detectar la presencia o ausencia del primer y tercer marcador en la primera mezcla en un primer recipiente; y

(c) detectar la presencia o ausencia del segundo y cuarto marcador en la segunda mezcla en un segundo recipiente;

mediante lo cual la presencia del primer y segundo marcador indica la presencia del primer agente biológico en la muestra, y la presencia del tercer y cuarto marcador indica la presencia del segundo agente biológico en la muestra, donde:

la primera mezcla comprende una primera sonda que reconoce específicamente el primer marcador y una tercera sonda que reconoce específicamente el tercer marcador;

la segunda mezcla comprende una segunda sonda que reconoce específicamente el segundo marcador y una cuarta sonda que reconoce específicamente el cuarto marcador;

cada una de las sondas tiene un marcador detectable, el marcador detectable de la primera sonda es igual que el marcador detectable de la segunda sonda, y el marcador detectable de la tercera sonda es diferente del marcador detectable de la cuarta sonda;

la etapa de detección (b) comprende determinar la presencia o ausencia de la primera y tercera sonda que se unen al primer y el tercer marcador en la primera mezcla;

la etapa de detección (c) comprende determinar la presencia o ausencia de la segunda y cuarta sonda que se unen al segundo y cuarto marcador en la segunda mezcla.

Los agentes biológicos que pueden identificarse usando el método de la invención incluyen células bacterianas, partículas víricas y toxinas biológicas. Los marcadores que pueden detectarse incluyen ácidos nucleicos, proteínas y polisacáridos. Los marcadores pueden detectarse en mezclas que incluyen, por ejemplo, soluciones, suspensiones, emulsiones o polvos.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un método para detectar de forma óptica la presencia o ausencia de varios agentes biológicos mayor que la cantidad de canales de color usados para detectar la presencia o ausencia de los agentes. Cada uno de los agentes biológicos tiene una primera y segunda secuencia de ácido nucleico respectivas que diferencian el agente biológico de los otros agentes biológicos. El método comprende la etapa de formar la primera y segunda mezcla en el primer y segundo recipiente, respectivamente, a partir de al menos una muestra que se sospecha que contiene los agentes. La primera mezcla contiene, para cada uno de los agentes biológicos, un conjunto de primera sonda respectivo para marcar la primera secuencia de ácido nucleico del agente biológico. La segunda mezcla contiene, para cada uno de los agentes biológicos, un conjunto de segunda sonda respectiva para marcar la segunda secuencia de ácido nucleico del agente... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para detectar al menos un primer y un segundo agentes biológicos, comprendiendo el primer agente un primer y un segundo marcadores, y comprendiendo el segundo agente un tercer y un cuarto marcadores, comprendiendo el método:

(a) preparar una primera y una segunda mezclas a partir de al menos una y la misma muestra que se sospecha que contiene los agentes;

(b) detectar la presencia o la ausencia del primer y del tercer marcadores en la primera mezcla en un primer recipiente; y

(c) detectar la presencia o la ausencia del segundo y del cuarto marcadores en la segunda mezcla en un segundo recipiente;

mediante lo cual la presencia del primer y del segundo marcadores indica la presencia del primer agente biológico en la muestra, y la presencia del tercer y del cuarto marcadores indica la presencia del segundo agente biológico en la muestra, en donde:

la primera mezcla comprende una primera sonda que reconoce específicamente el primer marcador y una tercera sonda que reconoce específicamente el tercer marcador;

la segunda mezcla comprende una segunda sonda que reconoce específicamente el segundo marcador y una cuarta sonda que reconoce específicamente el cuarto marcador;

cada una de las sondas tiene un marcador detectable, el marcador detectable de la primera sonda es igual que el marcador detectable de la segunda sonda, y el marcador detectable de la tercera sonda es diferente del marcador detectable de la cuarta sonda;

la etapa de detección (b) comprende determinar la presencia o la ausencia de la primera y de la tercera sondas que se unen al primer y al tercer marcadores en la primera mezcla;

la etapa de detección (c) comprende determinar la presencia o la ausencia de la segunda y de la cuarta sondas que se unen al segundo y al cuarto marcadores en la segunda mezcla.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el primer, el segundo, el tercer y el cuarto marcadores se seleccionan entre el grupo que consiste en ácidos nucleicos, proteínas y polisacáridos.

3. El método de la reivindicación 1, en el que:

(a) la primera, la segunda, la tercera o la cuarta sondas se selecciona entre el grupo que consiste en ácidos nucleicos y anticuerpos; o

(b) cada una de las sondas tiene un marcador fluorescente, el marcador fluorescente de la primera y segunda sondas tienen longitudes de onda máximas de emisión respectivas en 1 nm entre sí, y los marcadores fluorescentes de la tercera y cuarta sondas tienen longitudes de onda máximas de emisión respectivas que difieren en más de 1 nm; o

(c) las sondas y los marcadores son ácidos nucleicos y la detección de la presencia o de la ausencia de los marcadores en las mezclas se realiza usando PCR.

4. El método de la reivindicación 3, en el que al menos la primera sonda es una sonda de ácido nucleico, y al menos la cuarta sonda es un anticuerpo.

5. El método de la reivindicación 4, en el que

la detección de la presencia o de la ausencia del primer marcador comprende PCR que amplifica el primer marcador e híbrida la primera sonda con el marcador amplificado; o

la detección de la presencia o de la ausencia del cuarto marcador comprende la unión inmunoespecífica de la cuarta sonda al cuarto marcador.

6. El método de la reivindicación 1, en el que el primer, el segundo, el tercer y el cuarto marcadores comprenden una

primera, una segunda, una tercera y una cuarta secuencias de ácido nucleico, la primera mezcla contiene sondas de

hibridación para marcar la primera y la tercera secuencias de ácido nucleico, y la segunda mezcla contiene sondas de hibridación para marcar la segunda y la cuarta secuencias de ácido nucleico.

7. El método de la reivindicación 1, en el que se detectan al menos 3 agentes biológicos en la muestra.

8. El método de la reivindicación 1, en el que se detectan al menos 4 agentes biológicos en una muestra.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el método es para detectar de forma óptica la presencia o la ausencia de un número de agentes biológicos mayor que el número de canales de color usados para detectar la presencia o la ausencia de los agentes biológicos, teniendo cada uno de los agentes biológicos respectivas primera y segunda secuencias de ácido nucleico que diferencian al agente biológico de los otros agentes biológicos, comprendiendo el método las etapas de:

(a) formar la primera y la segunda mezclas en el primer y el segundo recipientes, respectivamente, a partir de al menos una y la misma muestra que se sospecha que contiene los agentes biológicos, en donde:

(i) la primera mezcla contiene, para cada uno de los agentes biológicos, un conjunto respectivo de primera sonda para marcar la primera secuencia de ácido nucleico del agente biológico;

(ii) la segunda mezcla contiene, para cada uno de los agentes biológicos, un conjunto respectivo de segunda sonda para marcar la segunda secuencia de ácido nucleico del agente biológico;

(iii) al menos dos de los conjuntos de primera sonda en la primera mezcla tienen los mismos intervalos de longitud de onda de emisión a detectar en el mismo canal de color, y los al menos dos conjuntos correspondientes de segunda sonda en la segunda mezcla tienen diferentes intervalos de longitud de onda de emisión a detectar en diferentes canales de color;

(b) leer de forma óptica la presencia o la ausencia de señales de sonda a partir de los al menos dos conjuntos de primera sonda en la primera mezcla que tienen los mismos intervalos de longitud de onda de emisión;

(c) leer de forma óptica la presencia o la ausencia de señales de sonda a partir de los al menos dos conjuntos correspondientes de segunda sonda en la segunda mezcla que tienen diferentes intervalos de longitud de onda de emisión; y

(d) determinar a partir de la combinación de señales de sonda recibidas de cada una de la mezclas la presencia o la ausencia de los agentes biológicos.

1. Un método para detectar al menos un primer y un segundo agentes biológicos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el método comprende:

(a) preparar una primera mezcla en un primer recipiente a partir de al menos una muestra que se sospecha que contiene los agentes;

(b) detectar la presencia o la ausencia del primer y del tercer marcadores en el primer recipiente;

(c) si cualquiera del primer o del tercer marcadores está presente en el primer recipiente, preparar una segunda mezcla en un segundo recipiente a partir de al menos una muestra; y

(d) detectar la presencia o la ausencia del segundo y del cuarto marcadores en el segundo recipiente;

mediante lo cual la presencia del primer y del segundo marcadores indica la presencia del primer agente biológico en la muestra, y la presencia del tercer y del cuarto marcadores indica la presencia del segundo agente biológico en la muestra.

11. El método de la reivindicación 1, en el que el primer, el segundo, el tercer y el cuarto marcadores comprenden una primera, una segunda, una tercera y una cuarta secuencias de ácido nucleico, la primera mezcla contiene reactivos y sondas para amplificar y detectar la primera y la tercera secuencias de ácido nucleico, y la etapa de detección de la presencia o de la ausencia del primer y del tercer marcadores en el primer recipiente comprende someter la primera mezcla a condiciones de amplificación de ácido nucleico y determinar a partir de las señales de sonda si cualquiera de la primera o de la tercera secuencias de ácido nucleico está presente en la primera mezcla.

12. El método de la reivindicación 11, en el que la segunda mezcla contiene reactivos y sondas para amplificar y detectar la segunda y la cuarta secuencias de ácido nucleico, y la etapa de detección de la presencia o de la ausencia del segundo y del cuarto marcadores en el segundo recipiente comprende someter la segunda mezcla a condiciones de amplificación de ácido nucleico y determinar a partir de las señales de sonda si cualquiera de la segunda o de la cuarta secuencias de ácido nucleico está presente en la segunda mezcla.

13. Un sistema para detectar al menos un primer y un segundo agentes biológicos a partir de al menos una y la misma muestra, en donde el primer agente comprende un primer y un segundo marcadores, y el segundo agente comprende un tercer y un cuarto marcadores, comprendiendo el sistema:

(a) al menos un primer y un segundo recipientes, alojando el primer recipiente reactivos para detectar el primer y el tercer marcadores y alojando el segundo recipiente reactivos para detectar el segundo y el cuarto marcadores, comprendiendo dichos primeros reactivos una primera sonda que reconoce específicamente el primer marcador y una tercera sonda que reconoce específicamente el tercer marcador, comprendiendo dichos segundos reactivos una segunda sonda que reconoce específicamente el segundo marcador y una cuarta sonda que reconoce específicamente el cuarto marcador, en donde cada una de las sondas tiene un marcador detectable, el marcador detectable de la primera sonda es igual que el marcador detectable de la segunda sonda, y el marcador detectable de la tercera sonda es diferente del marcador detectable de la cuarta sonda;

(b) al menos un detector dispuesto para detectar la presencia o la ausencia de los marcadores en los recipientes;

y

(c) al menos un controlador en comunicación con el al menos un detector, estando programado el controlador con instrucciones legibles por ordenador para realizar una serie de operaciones que comprenden:

(i) iniciar una reacción de detección en el primer recipiente;

(ii) recibir datos del detector; y

(iii) determinar a partir de los datos la presencia o la ausencia del primer y del tercer marcadores en el primer recipiente; en donde si el primer o el tercer marcadores están presentes en el primer recipiente, el controlador realiza una segunda serie de operaciones que comprenden;

(iv) iniciar una segunda reacción de detección en el segundo recipiente;

(v) recibir datos adicionales del detector; y

(vi) determinar a partir de los datos adicionales la presencia o la ausencia del segundo o del cuarto marcadores en el segundo recipiente;

mediante lo cual la presencia del primer y del segundo marcadores indica la presencia del primer agente biológico en una muestra, y la presencia del tercer y del cuarto marcadores indica la presencia del segundo agente biológico en la muestra.

14. El sistema de la reivindicación 13, en el que los marcadores son ácidos nucleicos, los reactivos alojados en el primer recipiente son sondas de ácido nucleico que reconocen específicamente el primer y el tercer marcadores, y los reactivos alojados en el segundo recipiente son sondas de ácido nucleico que reconocen específicamente el segundo y el cuarto marcadores.

15. El sistema de la reivindicación 14, en el que la reacción de detección comprende amplificación de ácido nucleico.

16. El sistema de la reivindicación 13, en donde el sistema comprende al menos un primer y un segundo detectores en comunicación con el controlador, estando dispuesto el primer detector para detectar la presencia o la ausencia de uno o más de los marcadores en el primer recipiente, y estando dispuesto el segundo detector para detectar la presencia o la ausencia de uno o más de los marcadores en el segundo recipiente.

17. El sistema de la reivindicación 13, en el que el primer, el segundo, el tercer y el cuarto marcadores comprenden una primera, una segunda, una tercera y una cuarta secuencias de ácido nucleico, y en donde el primer y el segundo recipientes comprenden cartuchos para extraer ácido nucleico de una muestra y para alojar el ácido nucleico para detección.

18. El sistema de la reivindicación 13, en donde dicho sistema es un sistema automatizado para determinar la presencia o la ausencia de una pluralidad de agentes en al menos una y la misma muestra, comprendiendo cada uno de los agentes respectivas primera y segunda secuencias de ácido nucleico que diferencian el agente de los otros agentes, comprendiendo el sistema automatizado:

a) primera y segunda mezclas de reacción que se sospecha que contienen los agentes, conteniendo la primera mezcla de reacción reactivos y sondas para amplificar y detectar la primera secuencia de ácido nucleico de cada uno de los agentes, y conteniendo la segunda mezcla de reacción reactivos y sondas para amplificar y detectar la segunda secuencia de ácido nucleico de cada uno de los agentes;

b) al menos un sistema de control de la temperatura para someter dichas primera y segunda mezclas de reacción que se sospecha que contienen los agentes, a condiciones de amplificación de ácido nucleico;

c) al menos un mecanismo de detección dispuesto para detectar señales de sonda de las mezclas de reacción; y

d) al menos un controlador en comunicación con el al menos un sistema de control de la temperatura y con el al menos un mecanismo de detección, estando programado el controlador para realizar las etapas de:

i) enviar señales de control al sistema de control de la temperatura para someter la primera mezcla de reacción a condiciones de amplificación de ácido nucleico;

ii) determinar a partir de las señales de sonda recibidas de la primera mezcla de reacción si la primera secuencia de ácido nucleico de cualquiera de los agentes está presente en la primera mezcla de reacción;

iii) si la primera secuencia de ácido nucleico de cualquiera de los agentes está presente en la primera mezcla de reacción, entonces se envían señales de control al sistema de control de la temperatura para someter la segunda mezcla de reacción a condiciones de amplificación de ácido nucleico; y

iv) determinar a partir de las señales de sonda recibidas de la segunda mezcla de reacción si la segunda secuencia de ácido nucleico de cualquiera de los agentes está presente en la segunda mezcla de reacción;

mediante lo cual la presencia de la primera y de la segunda secuencias de ácido nucleico de cualquiera de los agentes es indicativa de la presencia de ese agente.

19. El sistema de la reivindicación 18, en donde el sistema comprende al menos un primer y un segundo mecanismos de detección en comunicación con el controlador, estando dispuesto el primer mecanismo de detección para detectar la presencia o la ausencia de una o más de las secuencias de ácido nucleico en la primera mezcla de reacción, y estando dispuesto el segundo mecanismo de detección para detectar la presencia o la ausencia de una o más de las secuencias de ácido nucleico en la segunda mezcla de reacción.