Procedimiento para la detección colorimétrica de lisozima en orina por nanopartículas agregadas de oro.

Procedimiento para la detección colorimétrica de lisozima en orina por nanopartículas agregadas de oro. La presente invención tiene por objeto un procedimiento que permite detectar lisozima en orina

, empleando nanopartículas de oro protegidas con iones citrato tras ser sometidas a un procedimiento de agregación.

Es una herramienta de diagnóstico médico eficaz que permitirá la detección de diversas patologías como algunos tipos de leucemia o enfermedades renales.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201400372.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE SEVILLA.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: CASTILLO HERNANDEZ,PAULA MARGARITA, PRADO GOTOR,Rafael.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/34 (en los que interviene una hidrolasa)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de los materiales por... > G01N21/33 (utilizando la luz ultravioleta (G01N 21/39 tiene prioridad))
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/493 (de orina)
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Procedimiento para la detección colorimétrica de lisozima en orina por nanopartículas agregadas de oro.

Fragmento de la descripción:

Procedimiento para la detección colorimétrica de lisozima en orina por nanopartículas agregadas de oro.

Objeto de la invención

La presente invención es una adición a la patente P201300722 de título "Procedimiento para la detección colorimétrica de lisozima por nanopartículas agregadas de oro", y tiene por objeto un procedimiento que permite detectar lisozima en orina, empleando para ello nanopartículas de oro protegidas con iones citrato siguiendo el procedimiento patentado previamente en disolución acuosa y que se presenta aquí extendido en orina y con algunas modificaciones.

Es una herramienta de diagnóstico médico eficaz que permitirá la detección en orina, de diversas patologías asociadas a variaciones en la concentración de lisozima como algunos tipos de leucemia y enfermedades renales.

Estado de la técnica

La lisozima es una proteína catiónica, de carácter fuertemente básico, descrita por primera vez por Fleming en 1922 (On remarkable bacteriolytic element found in tissues and secretions. Fleming, A.. Proc. Roy. Soc., London, Series B, 93, 306 (1922)). Su principal propiedad es la de producir la lisis de la pared celular de ciertos tipos de bacterias, por lo que tiene una función relacionada con la respuesta inmunitaria del organismo, y se halla presente de forma natural en secreciones como las lágrimas. Sin embargo, pronto se encontró, una relación entre la presencia de lisozima y ciertas alteraciones del sistema inmunitario, encontrándose ésta particularmente ligada a los leucocitos al reportarse su presencia en pus de pacientes infectados con diversas afecciones, entre ellas tuberculosis (Observations on a bacterilolytic substance ("lysozyme") found in secretions and tissues. Fleming, A. Allison, V. D., , Brit. J. Exp. Path. 13, 252 (1922)).

La producción de un exceso de lisozima, detectadle en orina y otros fluidos biológicos (tales como el suero sanguíneo) fue determinada como síntoma propio de la leucemia monocítica y mielomonocítica (ambas subtipos de la leucemia mieloide aguda) en la década de 1960, atribuyéndose su aparición en orina a su pequeño peso molecular (Serum and Urinary Lysozime (muraminidase) in Monocytic and Monomyelocytic Leukemia. Ossermann, E. F. Lawlor, D. The

Journal of Experimental Medicine 124, 921-951P. LAWL (1966)) (Leukocyte Lysozyme Activity in Myelocytic Leukemia. Noble, R.E. Fudenberg, H. H. Blood 30: 465-473 (1967)). Aunque se trata de un rasgo compartido con otros trastornos renales, tales como el síndrome nefrótico o ciertas infecciones del tracto urinario, se encontró que la producción de lisozima detectada en orina y en suero para casos de leucemia de tipo monocítico era marcadamente superior (25 - 420 pg/ml en orina frente a 10 - 30 pg/ml para otros trastornos de tipo no leucémico) siendo este fuerte exceso de lisozima, por tanto, un buen indicador de la presencia de la enfermedad (Serum and Urinary Lysozime (muraminidase) in Monocytic and Monomyelocytic Leukemia. Ossermann, E. F. Lawlor, D. The Journal of Experimental Medicine 124, 921-951P. LAWL (1966)). A pesar de existir una fuerte vinculación entre este exceso de lisozima y una producción anormal de leucocitos, el estudio de otras enzimas presentes en los mismos tales como la fosfatasa, la (3- glucuronidasa o la catepsina en orina no arrojó valores anormales para pacientes leucémicos; esto puede deberse o bien a que los leucocitos asociados a trastornos leucémicos generan una cantidad excesiva de lisozima con respecto a los leucocitos normales, o bien a que el resto de proteínas, debido a sus características fisicoquímicas, no se excretan de forma tan marcada en la orina. También se ha postulado que pueden existir alteraciones de la función renal aparejadas a estos tipos de leucemia, que causarían una disminución de la reabsorción de la lisozima en el riñón provocando lisozimuria (Serum and Urinary Proteins, Lysozyme (Muramidase), and Renal Dysfunction in Mono- and Myelomonocytic Leukemia. Pruzanski, W. Platts, M. E.. The Journal of Clinical Investigation, 49 1694-1708 (1970)).

Además, se han reportado alteraciones de los niveles normales de lisozima ligados a otros tipos de leucemias; por ejemplo, diversos estudios, describen que la leucemia linfoblástica aguda, que es considerada actualmente el principal tipo de leucemia infantil, causa una fuerte disminución de la concentración de lisozima en suero, habiéndose encontrado valores experimentales de alrededor de la mitad frente a los casos de control (Leukocyte Lysozyme Activity in Myelocytic Leukemia. Noble, R.E. Fudenberg, H. H.. Blood 30: 465-473 (1967)), (Biochemistry of Human Cáncer. Bodansky, O., Academic Press Inc. Nueva York, , pgs 239-240(1975)), (Serum lysozyme activity in children with hematological and malignant disorders. Moe PJ, Haneberg B, Finne PH. Acta Paediatr Scand., 64(6):830-2. (1975))

(Recurso Web de la American Cáncer Society, http://www.cancer.org/cancer/leukemiainchildren/index . (2014)).

Los métodos de determinación de lisozima en muestras biológicas en la actualidad se basan, en su mayoría, en la actividad catalítica de la enzima; así, Smolelis y Hartsell (The Determination of Lysozime. Smolelis, A. N. Hartsell, S. E., J Bacteriol., 58(6): 731-736 (1949)), describen un método general basado en una suspensión celular de M. Lysodeikticus, que se mezcla con la muestra problema de lisozima; tras un periodo de incubación de 20 minutos, se mide la transmitancia de la disolución y se determina la concentración de la muestra por comparación con una recta patrón.

Ossermann et al.desarrollaron un método para la detección de lisozima en orina empleando como indicador, de nuevo, preparaciones de M. Lysodeikticus sobre soporte de agar (Serum and Urinary Lysozime (muraminidase) in Monocytic and Monomyelocytic Leukemia. Ossermann, E. F. Lawlor, D., The Journal of Experimental Medicine 124, 921-951P. LAWL (1966)). Por incubación durante 12- 18 horas a temperatura ambiente, la enzima causa la aparición de "claros" en la preparación bacteriana al hidrolizar la pared celular; el diámetro de estas marcas se considera proporcional al logaritmo de la concentración de lisozima en la muestra. Selsted y Martínez describen en 1980 una variante del mismo método, adaptada para detectar concentraciones de hasta 5 pg/ml (A simple and ultrasensitive enzymatic assay for the quantitative determination of lysozyme in the picogram range. Selsted, M. E. Martínez, R. J., Analytical Biochemistry 109 1, 67- 70 (1980)).

Actualmente no existe ningún procedimiento de detección de lisozima en orina, el Kit actualmente disponible es únicamente para muestras de suero sanguíneo, empleado en hospitales (Human Lysozyme `NL NANORID Radial Immunodiffusion Kit), sólo para uso hospitalario y diagnóstico in Vitro.

Además de la complicación relativa a la necesidad de la extracción y tratamiento para las muestras hospitalarias del método convencional, nuestro procedimiento aporta ventajas adicionales. Una importantísima, es el tiempo de respuesta. Con la metodología que proponemos la detección de lisozima es inmediata. Resultados muy recientes muestran además que se puede cuantificar

la proteína en orina sin problemas con la presencia de otros interferentes. El método existente en suero sanguíneo NANORID, se basa en las medidas de los diámetros de los aros de precipitado formados por la interacción del antígeno presente en una muestra y el anticuerpo suministrado en un gel de agarosa. El kit descrito, y el gel en concreto que contiene caros anticuerpos, requiere una conservación (limitada a 2-8°C) y una preparación exhaustiva que debe realizar personal cualificado. En el protocolo afirman que el método presenta problemas en la medida del aro de precipitado por lo que los resultados son variables...

 


Reivindicaciones:

1Procedimiento colorimétrico para la detección y/o cuantificación de lisozima en orina, que comprende:

a) añadir un biosensor de color azul constituido por nanopartículas de oro protegidas con iones citrato (AuNPs) agregadas con NaCI, a una muestra problema de orina y

b) determinar el grado de desagregación de las nanopartículas a simple vista o mediante espectroscopia UV-visible tras el estudio del desplazamiento que se produce hacia menores valores en la longitud de onda (color rojo) en la muestra de orina que contiene lisozima.

2.- Procedimiento colorimétrico para la detección y/o cuantificación de lisozima en orina de acuerdo a la reivindicación 1, en el que las nanopartículas de Au tienen un diámetro de 10 nm y han sido sintetizadas mediante la reducción en medio acuoso de una sal de oro con citrato sódico.

3.- Procedimiento colorimétrico para la detección y/o cuantificación de lisozima en orina, de acuerdo a las reivindicaciones anteriores caracterizado porque las nanopartículas de oro están en disolución acuosa.

4.- Procedimiento colorimétrico para la detección y/o cuantificación de lisozima en orina de acuerdo a las reivindicaciones anteriores caracterizado porque en el procedimiento de preparación del biosensor se toman como punto de referencia las nanopartículas de oro que han sido agregadas de forma controlada.

5.- Procedimiento colorimétrico para la detección y/o cuantificación de lisozima en orina de acuerdo a la reivindicación 4, caracterizado porque el punto de referencia se establece mediante la adición sobre las nanopartículas de oro, de NaCI a una concentración 0.1 M y 10 minutos de espera para la estabilización. 6

6.- Procedimiento colorimétrico para la detección y/o cuantificación de lisozima en orina de acuerdo a las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la determinación de la concentración de lisozima de la muestra problema de orina

requiere, el valor obtenido en el punto de referencia según la reivindicación 5 y el valor obtenido para la muestra problema, logrado con un orden tiempos y concentración fijados.

7.- Procedimiento colorimétrico para la detección y/o cuantificación de lisozima en orina de acuerdo a la reivindicación 6, caracterizado porque el orden de adición fijado para obtener el valor de la muestra problema de lisozima es: primero las nanopartículas de oro (7.9x10'9M), posteriormente la sal NaCI (0,1 M) y un tiempo de espera de 10 minutos para su estabilización.

8.- Procedimiento colorimétrico para la detección y/o cuantificación de lisozima en orina de acuerdo a las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la determinación de la concentración de lisozima en orina (al menos 10'6 M) se realiza a simple vista o calculada por diferencia, mediante espectroscopia UV-vis, tras el estudio del desplazamiento que se produce hacia menores valores en la longitud de onda en la muestra que contiene lisozima.

9.- Uso del procedimiento colorimétrico para la detección y/o cuantificación de lisozima en orina de acuerdo a las reivindicaciones 1-8, para detectar/cuantificar la presencia de lisozima en una muestra de orina.