Cristales y cristales reticulados de Proteína A y métodos de uso de los mismos.

Una composición que comprende forma cristalina reticulada de Proteína A

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2010/048664.

Solicitante: SHENOY, BHAMI.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 625 Putnam Avenue Cambridge, MA 02139-4807 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: SHENOY,BHAMI, PATEL,REENA, MCGRATH,MARGARET, BALADI,SIBYL, KHALAF,NAZAR, RANDHAWA,CHANCHAI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/31 (de Staphylococcus (G))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Procedimientos generales de preparación de péptidos > C07K1/14 (Extracción; Separación; Purificación)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Procedimientos generales de preparación de péptidos > C07K1/36 (por una combinación de varios procesos de diferentes tipos)

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Fragmento de la descripción:

Cristales y cristales reticulados de Proteína A y métodos de uso de los mismos ANTECEDENTES

La Proteína A es una proteína de superficie de 40-60 kDa encontrada originalmente en la pared celular de la bacteria Staphylococcus aureus. Ha encontrado uso en investigación bioquímica debido a su capacidad para unirse a inmunoglobulinas. La Proteína A se une a proteínas de muchas especies de mamíferos, muy especialmente IgGs. Se une con la región Fc de inmunoglobulinas a través de la interacción con la cadena pesada. La Proteína A estafilocócica recombinante se produce a menudo en E. coli para uso en inmunología y otra investigación biológica. La Proteína A está acoplada a menudo a otras moléculas, tales como colorante fluorescente, enzimas, biotina, oro coloidal o yodo radioactivo, sin afectar al sitio de unión al anticuerpo. También se utiliza ampliamente acoplado a perlas magnéticas, de látex y de agarosa. La Proteína A está a menudo inmovilizada sobre un soporte sólido, y se usa como un método fiable para purificar IgG total a partir de mezclas proteicas brutas tales como suero o fluido ascítico, o se acopla con uno de los marcadores anteriores para detectar la presencia de anticuerpos. Los estudios de inmunoprecipitación con Proteína A conjugada a perlas también se usan habitualmente para purificar proteínas o complejos proteicos indirectamente a través de anticuerpos frente a la proteína o complejo proteico de interés. Además, se usa ampliamente en la purificación de anticuerpos monoclonales procedentes de una amplia variedad de fuentes.

El documento WO 97/36614 describe polímeros y conjugados poliméricos que comprenden Proteína A estafilocócica reticulada, o conjugado reticulado de superantígeno con Proteína A, o derivados funcionales reticulados de los mismos, que oscilan en tamaño de 12 kDa a 10.000 kDa, que son útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, tales como artritis reumatoide e ITP así como enfermedades neoplásicas. Se describen composiciones que comprenden polímeros químicamente reticulados de Proteína A sola o Proteína A y antitoxinas bacterianas, opcionalmente complejados además con inmunoglobulinas y componentes del complemento, así como métodos para obtener y usar estas composiciones en el tratamiento de enfermedades.

En el documento US 5619710 A se presenta una proteína (tal como una enzima o anticuerpo) inmovilizada reticulando cristales de la proteína con un agente de reticulación multifuncional. Los cristales de proteína reticulados se pueden liofilizar para el almacenamiento. Una proteína preferida es una enzima tal como termolisina, elastasa, asparaginasa, lisozima, lipasa o ureasa. Los cristales reticulados de enzima o anticuerpo se pueden usar en un ensayo, kit de diagnóstico o biosensor para detectar un analito, en un dispositivo extracorpóreo para alterar un componente de un fluido y en la producción de un producto tal como usando cristales de termolisina reticulados.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere, en parte, a la preparación de cristales de proteína reticulados de Proteína A (CLPCs) , producidos por ejemplo para desarrollar un sistema de Proteína A innovador (por ejemplo, sistema cromatográfico) para la purificación de anticuerpos. Los CLPCs de Proteína A ofrecen la ventaja de actividad de Proteína A muy concentrada combinada con estabilidad elevada y resistencia química. La concentración de Proteína A condensada reduce el tamaño de la columna (si se usa) , el volumen de tampón y el tiempo de procedimiento. Además, la reticulación de cristales de Proteína A puede evitar o disminuir la lixiviación de la Proteína A durante la purificación (por ejemplo, usando cromatografía) , por ejemplo, de inmunoglobulinas (por ejemplo, anticuerpos) . En conjunto, esto puede reducir el tiempo y coste de producción de los anticuerpos.

La invención se refiere a formas cristalinas reticuladas de Proteína A (“CLPC de Proteína A o CLPC”) o sus derivados y a sus usos para purificar inmunoglobulinas/anticuerpos o fragmentos Fab o Fc correspondientes, por ejemplo anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales de cultivo celular, anticuerpos terapéuticos, anticuerpos de cultivo bacteriano, suero, plasma, al uso de tales cristales de Proteína A para la inmunoprecipitación, y dispositivos extracorpóreos.

Se describen aquí composiciones que contienen una forma cristalina reticulada (CLPC) de Proteína A. En una realización, los cristales de Proteína A están reticulados con glutaraldehído. En algunas realizaciones, el cristal de Proteína A está reticulado con alrededor de 0, 02% a alrededor de 4% (p/v) de glutaraldehído. En todavía otras realizaciones, el cristal de Proteína A está reticulado con alrededor de 1, 00% (p/v) de glutaraldehído.

Las composiciones descritas aquí son más activas que las formas no cristalinas de Proteína A, debido a que tienen una mayor capacidad de unión. En una realización de esto, la capacidad de unión de las formas cristalinas reticuladas de Proteína A es al menos alrededor de 100% mayor que la capacidad de unión de la forma inmovilizada soluble a pH 7. En todavía otra realización, el cristal de Proteína A reticulado tiene al menos alrededor de 150% de la capacidad de unión de la forma inmovilizada no cristalina de Proteína A.

En una realización de la invención, los cristales de Proteína A de la invención son estables (retienen su capacidad de unión) a alrededor de pH 2 a alrededor de pH 12.

En otra realización, los cristales de Proteína A descritos aquí tienen 0, 0% de lixiviación de proteína cuando se

comparan con Proteína A no cristalina inmovilizada.

También se describe aquí el uso reticulado de las composiciones de Proteína A cristalina en una columna preempaquetada como material de columna, o en una membrana (impregnada) , o en un dispositivo extracorpóreo.

En todavía otra realización de la invención, se describen aquí kits que contienen las composiciones de Proteína A cristalina reticulada descritas aquí. Tales kits pueden contener otros reactivos, aparato de purificación, e instrucciones para usar las composiciones de Proteína A cristalina reticulada descritas aquí.

En una realización, la Proteína A cristalina reticulada se puede preempaquetar en una columna a usar como un material de purificación de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, por ejemplo purificación de anticuerpos monoclonales a partir de cultivo de células de mamíferos, purificación de anticuerpos monoclonales expresados en leche transgénica, o anticuerpos policlonales generados en suero.

Adicionalmente, se describen métodos para producir cristales de proteína reticulados a partir de Proteína A soluble recombinante. También se describen composiciones, por ejemplo composiciones farmacéuticas, que incluyen los cristales reticulados de Proteína A (“CLPC”) .

Según la invención, se proporcionan cristales de Proteína A reticulados. El agente reticulante puede ser multifuncional y, en ciertas realizaciones, el agente es un agente bifuncional, tal como glutaraldehído. En ciertas realizaciones, los cristales de Proteína A se reticulan con glutaraldehído a una concentración que no altera esencialmente la capacidad de unión, por ejemplo a una concentración de al menos alrededor de 0, 02% (p/v) . En algunas realizaciones, el nivel de reticulación del cristal de Proteína A es equivalente al producido mediante tratamiento con 0, 02% (p/v) de glutaraldehído. El nivel de reticulación se puede determinar mediante métodos conocidos en la técnica o descritos en este documento, por ejemplo determinando el nivel de lixiviación de la proteínas.

La invención también proporciona cristales... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una composición que comprende forma cristalina reticulada de Proteína A.

2. Un método para purificar una inmunoglobulina, que comprende poner en contacto una disolución que comprende

dicha inmunoglobulina con la composición de la reivindicación 1, de manera que dicha inmunoglobulina se adsorbe 5 sobre la Proteína A cristalina.

3. El método de la reivindicación 2, en el que dicha inmunoglobulina es un anticuerpo que es al menos uno de un anticuerpo terapéutico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monocatenario, un fragmento Fab, y un fragmento Fc.

4. El método de la reivindicación 2, en el que dicha inmunoglobulina es al menos una de un anticuerpo quimérico, un 10 anticuerpo completamente humano, y un anticuerpo humanizado.

5. El método de la reivindicación 2, en el que dicha inmunoglobulina pertenece a la clase IgG.

6. La composición de la reivindicación 1, en la que la forma cristalina reticulada de Proteína A está reticulada con glutaraldehído.

7. Un kit que comprende la composición de la reivindicación 1, e instrucciones escritas que describen su uso.

8. La composición de la reivindicación 1, en la que la forma cristalina reticulada de la Proteína A presenta una capacidad de unión mayor por una inmunoglobulina en comparación con una composición que comprende una cantidad correspondiente de una forma inmovilizada de Proteína A que no es una forma cristalina reticulada.

9. La composición de la reivindicación 1, en la que la concentración de agente de reticulación es suficiente para dar como resultado alrededor de 0, 0% de lixiviación de la Proteína A cuando se compara con una composición que comprende una cantidad correspondiente de una Proteína A inmovilizada que no es una forma cristalina reticulada con al menos la misma concentración de agente de reticulación.

10. La composición de la reivindicación 1, en la que la composición se usa en al menos uno de una columna preempaquetada, una membrana, y un dispositivo extracorpóreo.

11. Un procedimiento para la purificación de inmunoglobulinas, que comprende:

(a) mezclar un medio que contiene inmunoglobulinas con una disolución tampón que comprende una combinación de cationes y aniones a un pH en el intervalo de alrededor de pH 7, 0 a pH 10, dando como resultado un medio inmunoglobulínico tamponado;

(b) poner en contacto dicho medio inmunoglobulínico tamponado con un adsorbente que comprende una composición de la reivindicación 1, de manera que el adsorbente adsorbe suficientemente las inmunoglobulinas 30 presentes en dicho medio inmunoglobulínico tamponado;

(c) lavar el adsorbente que tiene inmunoglobulinas adsorbidas en él con dicha disolución tampón;

(d) poner en contacto dicho adsorbente que tiene inmunoglobulinas adsorbidas en él con una disolución tampón que tiene un pH en el intervalo de alrededor de pH 2 a pH 6, para eliminar las inmunoglobulinas adsorbidas del adsorbente; y

(e) recuperar en forma sustancialmente pura las inmunoglobulinas eliminadas.

12. Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que la puesta en contacto de dicho medio inmunoglobulínico tamponado con dicho adsorbente se logra en una columna que comprende dicho adsorbente.

13. Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicho medio que contiene inmunoglobulinas se obtiene de al menos uno de un hibridoma, suero de mamífero normal, suero de mamífero inmunitario, plasma de mamífero,

fluido ascítico de mamífero, fluido de cultivo tisular, fluido de cultivo de células de mamífero, fluido de cultivo de células bacterianas, fluido de cultivo de levaduras, fluido de fuente transgénica, y extracto vegetal que contiene inmunoglobulinas.

14. Un método para obtener forma cristalina de Proteína A usando el método de cristalización por difusión de vapor en gota colgante o el método de cristalización por lotes, que comprende las etapas de:

(a) colocar Proteína A en agua desionizada a una relación de proteína reactivo 1:1, en el que dicho reactivo se selecciona del grupo que consiste en una composición que contiene sulfato de amonio 2 M, tampón de cacodilato 0, 1 M pH 6, 5 y NaCl 0, 2 M; sulfato de amonio 2 M en tampón de citrato pH 5, 5; citrato de sodio 1 M, tampón de Tris-HCl 0, 1 M pH 7, y NaCl 0, 2 M; NaH2PO4 0, 8 M/K2PO4 1, 2 M en tampón de acetato 0, 1 M pH 4, 5; y sulfato de amonio 2 M, tampón de Tris-HCl pH 7, y sulfato de litio 0, 2 M; y

(b) incubar hasta que se produce la formación de cristal.

15. Un método según la reivindicación 14, en el que la Proteína A en la etapa (a) está a una concentración de alrededor de 50, 6 mg/ml o alrededor de 120 mg/ml de Proteína A en agua desionizada.

16. Un método para obtener forma cristalina reticulada de Proteína A, que comprende mezclar forma cristalina de

Proteína A con glutaraldehído, en el que el glutaraldehído está opcionalmente a una concentración final de alrededor de 1%.

17. Un método de purificación de una inmunoglobulina a partir de una composición que comprende dicha inmunoglobulina, comprendiendo dicho método poner en contacto la composición que comprende la inmunoglobulina a purificar con la composición de la reivindicación 1.