Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España en los últimos 80 años. Clasificación Internacional de Patentes CIP 2013.

COMPUESTOS PEPTIDICOS ANTIBACTERIANOS.

Patente de Invención. Resumen:

Compuestos peptídicos antibacterianos.Los compuestos de fórmula (I), o retroenantiómeros de los mismos no acilados en su extremo N-terminal y con la configuración del aminoácido con la cadena lateral R{sub,2} no invertida cuando R{sub,2} es -CH

(CH{sub,3})(OH), donde: R{sub,0} es CH{sub,3}-(CH{sub,2}){sub,m}-, CH{sub,3}-O-(CH{sub,2}CH{sub,2}O)2CH{sub,2}- o fenil-(CH{sub,2}){sub,x}-; m es un entero entre 7 y 10; x es un entero entre 1 y 3; R{sub,1}, R{sub,3}, R{sub,4}, R{sub,7} y R{sub,8} se seleccionan independientemente de la fórmula GF(CH{sub,2}){sub,n}- donde n es un entero entre 1 y 4; y GF es -NH{sub,2}, -NH-C(=NH)-NH{sub,2} o 4 imidazolilo; R{sub,2} es -CH(CH{sub,3})(OH), -CH(CH{sub,3}){sub,2}, -CH{sub,2}NH{sub,2} o -CH{sub,2}OH; R{sub,5} y R{sub,6} son (C{sub,1}-C{sub,4})-alquilo lineal o ramificado, -(CH{sub,2})-R{sub,10}, -CH{sub,2}-CH{sub,2}-S-CH{sub,3} o -CH{sub,2} CH{sub,2} S(=O)-CH{sub,3}; R{sub,9} es H o Gly-espermida; y R{sub,10} es fenilo, 3-indolilo, 4 imidazolilo, 4-hidroxifenilo, alfa o beta-naftilo o 2-, 3- ó 4-piridilo, se ha encontrado que son útiles en el tratamiento de infecciones bacterianas.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: BARCELONA.

Inventor/es: RABANAL ANGLADA,FRANCESC, CAJAL VISA,YOLANDA, RODRIGUEZ NUÑEZ,MONTSERRAT, GARCIA SUBIRATS,MARIA.

Fecha de Solicitud: 10 de Septiembre de 2008.

Fecha de Publicación de la Concesión: 3 de Diciembre de 2010.

Fecha de Concesión: 23 de Noviembre de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes: A61K38/12 (..Péptidos cíclicos [6]), C07K7/62 (....Polimixinas; Péptidos semejantes [4]).

Clasificación PCT: A61P31/04 (.Agentes antibacterianos [7]), A61K38/12 (..Péptidos cíclicos [6]), C07K7/62 (....Polimixinas; Péptidos semejantes [4]).

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COMPUESTOS PEPTIDICOS ANTIBACTERIANOS.
Descripción:

Compuestos peptídicos antibacterianos.

La presente invención está relacionada con compuestos que son activos contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, su procedimiento de preparación, composiciones farmacéuticas que los contienen, y su uso en el tratamiento de infecciones bacterianas.

Estado de la técnica

El hecho de que ciertos microorganismos patógenos se hayan convertido en resistentes a las terapias antibióticas es un problema grave en la salud pública. Parte de este problema radica en el hecho de que ciertas bacterias y otros microorganismos infecciosos son extraordinariamente capaces de desarrollar resistencia a los antibióticos. Otra causa principal se debe al uso deficiente de los antibióticos en medicina, veterinaria y agricultura.

Existe una preocupación a nivel mundial por la creciente prevalencia de infecciones causadas por bacterias multiresistentes, como por ejemplo Staphylococcus aureus resistente a metilicina, los Enterococcus resistentes a vancomincina y ciertas bacterias Gram-negativas como Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii y Klebsiella pneumoniae. Dichas infecciones son muy difíciles de controlar y una causa constante de enfermedad y mortandad. Los antibióticos convencionales actúan habitualmente sobre una o mas proteínas o receptores diana y la resistencia genética aparece a una frecuencia que depende de muchos factores, tales como el número de dichas proteínas o receptores diana.

La continua aparición de cepas bacterianas resistentes a los antibióticos convencionales está llevando a enormes esfuerzos dirigidos al desarrollo de nuevos fármacos que actúen en la membrana bacteriana, como los péptidos antimicrobianos ("anti-microbial peptides", AMP). Los péptidos antimicrobianos ofrecen una nueva clase de agentes terapéuticos a los cuales las bacterias no son capaces de desarrollar resistencia genética, puesto que actúan principalmente sobre el componente lipídico de las membranas celulares. Entre dichos compuestos, la polimixina B (PxB), que se halla aprobada para su uso clínico, esta adquiriendo una nueva relevancia terapéutica y está empezando a ser considerado como un representante de la clase de antibióticos activos contra bacterias multiresistentes.

Las polimixinas, en particular la polimixina B, constituyen una familia de antibióticos descubierta en 1947 con una elevada actividad contra bacterias Gram-negativas. La polimixina B es un lipopéptido antibiótico aislado de Bacillus polymyxa. Su estructura básica consiste en un ciclo peptídico policatiónico del cual pende un tripéptido unido a una cadena de ácido graso. La polimixina B ha resurgido en la práctica médica durante los últimos años y su uso continuará en aumento debido al escaso desarrollo de nuevos antibióticos por parte de la compañías farmacéuticas y a la creciente prevalencia mundial de infecciones nosocomiales causadas por bacterias Gram-negativas multiresistentes ("multidrug resistant", MDR). La polimixina B y otros miembros de la familia de las polimixinas son fármacos que se utilizan como último remedio para tratar infecciones causadas por bacterias multiresistentes y algunas veces son el único antibiótico activo disponible. Además, la resistencia a polimixina es rara y en general, adaptativa y, por tanto, reversible. La polimixina B es también capaz de inhibir la actividad biológica del lipopolisacárido (LPS) bacteriano por medio de la unión de alta afinidad al lípido A, siendo así el agente de elección para el tratamiento del shock séptico inducido por LPS. Desgraciadamente, la polimixina B no presenta actividad contra bacterias Gram-positivas o anaeróbicas. Además, las polimixinas son de uso limitado debido a que presentan cierta nefrotoxicidad y neurotoxicidad.

Por todo ello, existe todavía la necesidad de encontrar nuevos agentes antibacterianos activos no sólo contra bacterias Gram-negativas sino también contra bacterias Gram-positivas.

Explicación de la invención

Los inventores han encontrado algunos compuestos peptídicos con actividad antibiótica que actúan sobre el componente lipídico de las membranas bacterianas y que son activos tanto contra bacterias Gram-positivas como contra Gram-negativas. Estos compuestos se basan en la estructura de la polimixina natural. Sin embargo y a diferencia de las polimixinas, dichos compuestos son activos no sólo contra bacterias Gram-negativas sino también en Gram-positivas en el rango micromolar. Esto es ventajosos puesto que pueden actuar en respuesta a infecciones causadas por ambos tipos de bacteria.

Así, un aspecto de la presente invención es el proporcionar compuestos de fórmula (I),


o retroenantiómeros de los mismos de fórmula (I'),


donde

R0 es un radical seleccionado entre CH3-(CH2)m-, CH3-O-(CH2CH2O)2CH2-, y

m es un entero entre 7 y 10; x es un entero entre 1 y 3; R1, R3, R4, R7, y R8 son radicales seleccionados independientemente que responden a la fórmula: GF-(CH2)n-; n es un entero entre 1 y 4; GF es un radical seleccionado entre -NH2(amino), -NH-C(=NH)-NH2(guanidino) y 4-imidazolilo; R2 es un radical seleccionado entre -CH(CH3)(OH), -CH(CH3)2, -CH2NH2 y -CH2OH; R5 y R6 son radicales seleccionados entre: -(C1-C4)-alquilo lineal o ramificado; -(CH2)-R10, -CH2-CH2-S-CH3, y -CH2-CH2-S(=O)-CH3, R9 es H o Gly-NHCH2CH2CH2NHCH2CH2CH2CH2NHCH2CH2CH2 NH2(Gly-espermida); y R10 es un radical seleccionado entre fenilo, 3-indolilo, 4-imidazolilo, 4-hidroxifenilo, naftilo y piridilo; con la condición de que el compuesto de fórmula (I) no es uno de los compuestos de la siguiente lista, que se han descrito previamente, pero no su aplicación como agentes antibacterianos contra bacterias Gram-positivas:

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Cys], (sp-B);

nonanoil-Dap-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Dap-Dab-Cys], (sP-D);

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Met-Dab-Dab-Cys], (sp-Met);

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Met(O)-Dab-Dab-Cys]; (sp-Met(O)); o

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DTrp-Leu-Dab-Dab-Cys], (sp-Bw).

Por el término "ciclo(S-S)" se entiende un macrociclo formado por un puente disulfuro entre las dos cisteínas.

Un retroenantiómero de un péptido es un análogo peptídico que consiste en la secuencia de aminoácidos reversa respecto al péptido original con inversión simultánea de la configuración de los estereocentros, en particular los del carbono alfa de cada aminoácido. Es conocido que los retroenantiómeros de ciertos péptidos y depsipéptidos cíclicos mantienen la actividad biológica a pesar de que la dirección del enlace amida (definido en el sentido del átomo de carbono del carbonilo al átomo de nitrógeno) que une los residuos se haya invertido (cf. M. Goodman et al.,"On the concept of linear modified retro-peptide structures", Acc. Chem. Res. 1979 vol. 12, pp. 1-7). La actividad biológica se atribuye a la orientación tridimensional de las cadenas laterales y no al esqueleto peptídico.

El compuesto retroenantiomérico (I') es un péptido análogo que consiste en la secuencia de aminoácidos reversa del compuesto (I) con inversión simultánea de la configuración de todos los centros quirales excepto el del aminoácido con la cadena lateral R2 cuando dicho R2 es treonina, y que no necesariamente se halla acilado en su extremo N-terminal.

En una realización preferida, los compuestos de fórmula (I) o (I') son aquéllos anteriormente mencionados donde R2 es -CH(CH3)(OH), es decir, R2 es la cadena lateral de la treonina.

Los compuestos preferidos de fórmula (I) son aquéllos seleccionados de la siguiente lista:

nonanoil-Arg-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Arg-Dab-Cys], (sp-2Arg);

nonanoil-Arg-Thr-Arg-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Arg-Dab-Cys], (sp-3Arg);

nonanoil-Arg(NO2)-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Arg(NO2)-Dab- Cys], (sp-2Arg(NO2);

nonanoil-Arg-Thr-Arg-ciclo(S-S)[Cys-Arg-DPhe-Leu-Arg-Arg-Cys], (sp-5Arg);

nonanoil-Dap[C(NH)-NH2]-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Dap[C(NH)- NH2]-Dab-Cys], (sP-2Dap guanidilado); y

nonanoil-Arg-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Arg-Dab-Cys]-Gly-NHCH2CH2CH2NHCH2CH2CH2 CH2NHCH2CH2CH2NH2, (sP-2Arg-Gly-espermida).

Los compuestos preferidos de fórmula (I') son aquéllos seleccionados de la siguiente lista:

ciclo(S-S)[DCys-DDab-DArg-DLeu-Phe-DDab-DCys]-DDab-DThr-DArg-octilamida, (sP-2Arg retroenantio); y

ciclo(S-S)[DCys-DDab-DDab-DLeu-Phe-DDab-DCys]-DDab-DThr-DDab-octilamida, (sP-B retroenantio).

Los compuestos de la presente invención pueden prepararse por síntesis en fase sólida Fmoc. El procedimiento de preparación para cada aminoácido puede comprender las etapas siguientes: (i) varios lavados de la resina con N,N-dimetilformamida (DMF); (ii) tratamiento con 20% de piperidina/DMF; (iii) lavado con DMF varias veces; (iv) acilación con el aminoácido Fmoc protegido y N,N'-diisopropilcarbodiimida/1-hidroxibenzotriazol (DIPCDI/HOBt) en DMF; (v) lavado con DMF varias veces y posteriormente en diclorometano (CH2Cl2) varias veces; (vi) prueba de Kaiser (con una muestra de resina peptídica); y (vii) lavado con DMF varias veces.

También se pueden preparar por síntesis en fase sólida Boc. En este caso el procedimiento de preparación para cada aminoácido puede comprender las etapas siguientes: (i) lavado de la resina con CH2Cl2 varias veces; (ii) tratamiento con 40% de ácido trifluoroacético (TFA)/CH2Cl2 ;(iii) lavado de la resina con CH2Cl2 varias veces; (iv) tratamiento con 5% DIEA/CH2Cl2 varias veces; (v) lavado de la resina con CH2Cl2 varias veces; (vi) lavado de la resina con DMF varias veces; (vii) acilación con el aminoácido Boc protegido y hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(pirrolidino)fosfonio hexafluorofosfato (PyBOP) y N,N-diisopropiletilamina (DIEA) en la cantidad mínima de DMF; (viii) lavado con DMF varias veces y CH2Cl2 varias veces; y (ix) prueba de Kaiser (con una muestra de resina peptídica). En la etapa (vii) en lugar de PyBOP y DIEA puede utilizarse DIPCDI/HOBt.

Los péptidos obtenidos por los procedimientos anteriores pueden purificarse por HPLC preparativa, mediante lo cual puede obtenerse una pureza superior al 99%.

Así, los compuestos de la presente invención se preparan fácilmente por síntesis química según los procedimientos mencionados anteriormente mientras que la polimixina comercial se obtiene por fermentación.

Otro aspecto de la presente invención son los compuestos de fórmula (I) o (I'), así como cualquiera de los siguientes compuestos:

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Cys], (sp-B);

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Dab-Leu-Dab-Cys], (sp-C);

nonanoil-Dap-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Dap-Dab-Cys], (sP-D);

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Met-Dab-Dab-Cys], (sp-Met);

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Met(0)-Dab-Dab-Cys], (sp-Met(O)); o

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)fCys-Dab-DTrp-Leu-Dab-Dab-Cys], (sp-Bw);

para uso como agentes antibacterianos contra bacterias Gram-positivas. Entre las bacterias Gram-positivas médicamente relevantes se encuentran varias de género bien conocido tales como Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Mycoplasma y Actinobacteria.

En una realización preferida, las bacterias Gram-positivas se seleccionan entre Micobacterium phlei, Staphylococcus aureus y Bacillus cereus var. Mycoides. En una realización particular, las bacterias Gram-positivas se seleccionan entre Staphylococcus aureus 6538 y Bacillus cereus var. mycoides 11778.

Este aspecto de la invención se puede formular también como el uso de un compuesto como se ha definido anteriormente, incluyendo los compuestos conocidos mencionados para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una infección bacteriana causada por bacterias Gram-positivas en un mamífero, incluyendo un humano.

La invención también está relacionada con un método para el tratamiento y/o la profilaxis de un mamífero, incluyendo un humano, que sufre o es susceptible a infecciones bacterianas causada por bacterias Gram-positivas, en particular a las infecciones mencionadas anteriormente, dicho método comprendiendo la administración al mencionado paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de compuestos de la presente invención, incluyendo los compuestos conocidos mencionados anteriormente, junto a excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.

Es también parte de la invención los compuestos de fórmula (I) o (I') como se han definido anteriormente para su uso como agentes antibacterianos contra bacterias Gram-negativas. Las bacterias Gram-negativas médicamente relevantes comprenden Escherichia coli, Salmonella, Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Moraxella, Helicobacter, Legionella, Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens y Acinetobacter baumanii.

En una realización preferida, las bacterias Gram-negativas se seleccionan entre Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli. En una realización particular, las bacterias Gram-negativas se seleccionan entre Salmonella typhimurium 14028, Pseudomonas aeruginosa 9027 y Escherichia coli 8739. Este aspecto de la invención puede ser también formulado como el uso de un compuesto de fórmula (I) o (I') como se ha definido anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una infección bacteriana causada por bacterias Gram-negativas en un mamífero, incluyendo un humano.

La invención también está relacionada con un método para el tratamiento y/o la profilaxis de un mamífero, incluyendo un humano que sufra o es susceptible a infecciones bacterianas causada por bacterias Gram-negativas, en particular a alguna de las infecciones mencionadas anteriormente, el método comprendiendo la administración al mencionado paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de los compuestos de fórmula (I) o (I') como se han definido anteriormente, junto a excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.

Los compuestos de la presente invención se pueden utilizar análogamente a otros agentes antibacterianos conocidos. Estos se pueden utilizar solos o en combinación con otros compuestos bioactivos apropiados. En una realización particular, los compuestos de fórmula (I) o (I') se pueden utilizar en el tratamiento de bacteremias y/o septicemia consecuencia de infecciones por bacterias Gram-negativas, administrados solos o en combinación con antibióticos convencionales. En una realización preferida, los compuestos de fórmula (I) o (I') de la presente invención se usan por vía tópica, o bien por vía oral para la descontaminación del tracto digestivo previa a cirugía.

Como se ha mencionado anteriormente, estos compuestos presentan la ventaja de que pueden actuar sobre un espectro amplio de bacterias y debido a que aparentemente se cree que actúan sobre la membrana, pueden resultar más efectivos que otros antibióticos que actúan sobre un receptor o enzima frente a la resistencia a los antibióticos.

Un aspecto adicional de la presente invención está relacionado con una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de los compuestos de fórmula (I) o (I'), junto con cantidades apropiadas de excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar por combinación de los compuestos de fórmula (I) o (I') de la presente invención con excipientes o portadores sólidos o líquidos farmacéuticamente aceptables, siguiendo prácticas farmacéuticas estándar.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de manera adecuada para la enfermedad que se desea tratar, por ejemplo por vía oral, parenteral, inhalatoria, rectal, transdérmica o tópica. En el uso terapéutico para tratar o combatir infecciones bacterianas en pacientes como los humanos y otros animales que pudieren ser diagnosticados con infecciones bacterianas, dichos compuestos o composiciones farmacéuticas, preferentemente, se administran a una dosis para obtener o mantener una concentración, o sea, una cantidad o nivel en sangre del componente activo en el paciente que sigue el tratamiento que sea efectiva como antibacteriano. Generalmente, dicha cantidad o dosis que sea efectiva como antibacteriano se encontrará en el intervalo aproximado de 0.1 a 100 mg/Kg, más preferentemente alrededor de 3.0 a 50 mg/Kg de peso corporal/día. Se entiende que las dosis pueden variar dependiendo de los requisitos del paciente, la severidad de la infección bacteriana a tratar y del compuesto particular que se use.

Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de grupos particulares mencionados previamente.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variaciones no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no pretenden que sean limitativos de la presente invención.

Ejemplos

Abreviaciones: Acm, acetamidometilo; AcOH, ácido acético; Boc, terc-butoxicarbonilo; Bn, bencilo; Dab: ácido 2,4-diaminobutírico; DMAP, N,N-dimetilaminopiridina; DIEA, N,N-diisopropiletilamina; DIPCDI, N,N'-diisopropilcarbodiimida; DMF, N,N-dimetilformamida; ES, electrospray; Fmoc, 9-fluorenilmetoxicarbonilo; HOBt, 1-hidroxibenzotriazol; HPLC, cromatografía liquida de alta eficacia; MALDI-TOF, ionización por desorción láser asistida por matriz-tiempo de vuelo; MBHA, resina 4-metilbencidrilamina; MIC, concentración mínima inhibitoria; Pmc, 2,2,5,7,8-pentametil-cromano-6-sulfonilo; PyBOP, hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(pirrolidino)fosfonio; TES: trietilsilano; TFA, ácido trifluoroacético; TIS: triisopropilsilano; TMS-Cl, cloruro de trimetilsililo; Trt, tritilo; DAB, ácido 2,4-diaminobutírico.

Métodos generales

Se han empleado dos métodos para preparar los compuestos de los ejemplos: síntesis en fase sólida Fmoc y síntesis en fase sólida Boc.

Protocolo de síntesis Fmoc: para cada ciclo de aminoácido consiste en las etapas siguientes: (i) lavado de la resina con DMF (5 x 30 s); (ii) tratamiento con 20% de piperidina/DMF (1 x 1 min. + 2 x 10 min., desprotección Fmoc); (iii) lavado con DMF (5 x 30 s); (iv) acilación con el aminoácido Fmoc protegido (3 veces de exceso) y DIPCDI/HOBt (3 veces de exceso) en la cantidad mínima de DMF; (v) lavado con DMF (5 x 30 s) y CH2Cl2 (5 x 30 s); (vi) prueba de Kaiser (con una muestra de resina peptídica); (vii) lavado con DMF (5 x 30 s).

Protocolo de síntesis Boc: para cada ciclo de aminoácido consiste en las etapas siguientes: (i) lavado de la resina con CH2Cl2 (5 x 30 s); (ii) tratamiento con 40% de ácido trifluoroacético/CH2Cl2 (1 x 1 min. + 2 x 10 min., eliminación Boc); (iii) lavado de la resina con CH2Cl2 varias veces; (iv) tratamiento con 5% DIEA/CH2Cl2 varias veces; (v) lavado de la resina con CH2Cl2 (5 x 30 s); (vi) lavado de la resina con DMF (5 x 30 s); (vii) acilación con el aminoácido Boc protegido (3 veces de exceso) y PyBOP (3 veces de exceso) y DIEA (9 veces de exceso) en la cantidad mínima de DMF; (viii) lavado con DMF (5 x 30 s) y CH2Cl2 (5 x 30 s); (ix) prueba de Kaiser (con una muestra de resina peptídica). En la etapa (vii) en lugar de PyBOP y DIEA alternativamente puede utilizarse DIPCDI/HOBt.

La purificación se llevó a cabo por HPLC preparativa. En los Ejemplos se empleo un equipo Waters Delta Prep 3000 system con una columna Phenomenex C18 (2) (250 x 10 mm, 5 μm) y se eluyó en gradiente con mezclas de H2O-acetonitrilo-0.1% TFA y detección UV a 220 nm.

Los péptidos se caracterizaron por análisis de aminoácidos con un analizador Beckman 6300 y por espectrometría de masas MALDI-TOF en un espectrómetro de masas VOYAGER-DE-RP (Applied Biosystems) o en un espectrómetro de masas Electrospray (ESI+) ZQ-Micromass (Waters) o en espectrómetro de masas ESI + LC/ MSD-TOF (Agilent Technologies). La homogeneidad de los péptidos purificados se comprobó por HPLC analítica empleando columnas Nucleosil C18 de fase reversa (4 x 250 mm, 5 μm de diámetro de partícula y una medida de poro de 120 Å). La elución se llevó a cabo a 1 ml•min-1 con mezclas de H2O-0.045% TFA y acetonitrilo-0.036% TFA y detección UV a 220 nm.

Ejemplo 1

Preparación de nonanoil-Arg-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Arg-Dab-Cysl (compuesto de fórmula (I) con R0 = CH3(CH2)7-, R1 = -CH2CH2CH2NHC(=NH)-NH2 (cadena lateral de Arg), R4 = -CH2(CH3)OH, R3 = -CH2CH2 NH2 (cadena lateral de Dab), R4 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab), R5 = -CH2Ph (cadena lateral de DPhe), R6 = -CH2CH(CH3)2 (cadena lateral de Leu), R7 = -CH2CH2CH2NHC(=NH)-NH2 (cadena lateral de Arg), y R8 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab); sp-2Arq)

Aminoácidos protegidos: Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Dab(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-DPhe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH.

Se llevo a cabo la síntesis manual según un protocolo estándar Fmoc/tBu en jeringas de polipropileno con un filtro de polietileno. El espaciador ("linker") Fmoc-Rink (319 mg, 0.59 mmoles, 3 equiv. exceso) se ancló a la resina 4-MBHA-poliestireno (201 mg, f=0,98 mmol/g) por activación con DIPCDI (92 μL, 0.59 mmoles, 3 equivalentes exceso). Los aminoácidos de la secuencia se introdujeron según un protocolo estándar de síntesis en fase sólida Fmoc/tBu como se ha descrito anteriormente. Una vez la secuencia se completó, se acopló el ácido nonanoico (103,6 μl, 0.59 mmoles, 3 veces de exceso) con DIPCDI/HOBt en la cantidad mínima de DMF. Una vez concluida la reacción según se comprobó por la prueba de Kaiser (con una muestra de resina peptídica), la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y CH2Cl2 (5 x 30 s). Una vez el lipopéptido se completó, el enlace disulfuro se formó por oxidación con yodo (200.3 mg, 4 equiv.) en DMF durante dos horas. La resina se lavó con DMF (8 x 5 mL) y CH2Cl2 (5 x 5 mL).

El desanclaje y desprotección del péptido se realizó por acidólisis con TFA:trietilsilano:agua (95:3:2, v/v/v, 5 mL) durante 1.5 horas a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla acidolitica se evaporó con corriente de N2 y el residuo aceitoso se precipitó con éter etílico seco. El crudo peptídico se recuperó por centrifugación y decantación de la fase etérea. El peso del crudo peptídico fue 200 mg (rendimiento 76%, pureza 80%). Caracterización del péptido purificado: Homogeneidad (por integración del área de la traza de HPLC) >99%; MALDI-TOF: m/z 1335.32 ([M+H]+, 100%), 1357.31 ([M+Na]+, 16.8%).

Ejemplo 2

Preparación de nonanoil-Arg-Thr-Arg-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Arg-Dab-Cys] (Compuesto (I) con R0 = CH3(CH2)7-, R1 = -CH2CH2CH,NHC(=NH)-NH2 (cadena lateral de Arg), R2 = -CH(CH3)OH, R3 = -CH2CH2CH2 NHC(=NH)-NH2 (cadena lateral de Arq), R4 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab), R5 = -CH2Ph (cadena lateral de DPhe R6 = -CH2CH(CH3)2 cadena lateral de Leu), R7 = -CH2CH2CH2NHC(NH)-NH2 (cadena lateral de Arg), y R8 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab); sp-3Arg)

Aminoácidos protegidos: Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Dab(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-DPhe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH.

Se llevo a cabo la síntesis manual según un protocolo estándar Fmoc/tBu en jeringas de polipropileno con un filtro de polietileno. El primer aminoácido de la secuencia, Fmoc-Cys(Acm)-OH, se ancló directamente a la resina 4-MBHA-poliestireno (151,4 mg, f=0,98 mmol/g). Los aminoácidos de la secuencia se introdujeron según un protocolo estándar de síntesis en fase sólida Fmoc/tBu como se ha descrito anteriormente. Una vez la secuencia se completó, se acopló el ácido nonanoico (78,0 μl, 0,45 mmoles, 3 veces de exceso) con DIPCDI/HOBt en la cantidad mínima de DMF. Una vez concluida la reacción según se comprobó por la prueba de Kaiser (con una muestra de resina peptídica), la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y CH2Cl2 (5 x 30 s). Una vez el lipopéptido se completó, el enlace disulfuro se formó por oxidación con yodo (150,6 mg,, 4 equiv.) en DMF durante dos horas. La resina se lavó con DMF (8 x 5 mL) y CH2Cl2 (5 x 5 mL).

El desanclaje y desprotección del péptido se realizó por acidólisis con TFA:TMS-Cl:HBr (33% in AcOH): trietilsilano (3,21 ml TFA, 1,29 ml TMS-Cl, 0,25 ml TES, 0,25 ml HBr, volumen total 5 ml) durante 3 horas a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla acidolítica se evaporó con corriente de N2 y el residuo aceitoso se precipitó con éter etílico seco. El crudo peptídico se recuperó por centrifugación y decantación de la fase etérea. El peso del crudo peptídico fue 75.1 mg (rendimiento 82%, pureza 80%). Caracterización del péptido purificado: Homogeneidad (por integración del área de la traza de HPLC) >99%; MALDI-TOF: m/z 1391.73 ([M+H]+, 32.9%), 1413.70 ([M+Na]+, 100%).

Ejemplo 3

Preparación de nonanoil-Arg(NO2)-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Arg(NO2)-Dab-Cys] (Compuesto (I) con R0 = CH3(CH2)7-, R1 = -CH2CH2CH2NHC(=NH)-NH-NO2 (cadena lateral de Arq(NO2)), R2 = - CH(CH3)OH, R3 = CH2CH2NH2, (cadena lateral de Dab), R4 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab), R5 = -CH2Ph (cadena lateral de DPhe), R6 = -CH2CH(CH3)2 (cadena lateral de Leu) R7 = -CH2CH2CH2NHC(=NH)-NH-NO2 (cadena lateral de Arg(NO2)) y R8 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab); sp-2Arg(NO2)

Aminoácidos protegidos: Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Dab(Boc)-OH, Fmoc-Arg(NO2)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-DPhe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH.

Se llevo a cabo la síntesis manual según un protocolo estándar Fmoc/tBu en jeringas de polipropileno con un filtro de polietileno. El espaciador ("linker") Fmoc-Rink (329 mg, 0.61 mmoles, 3 equiv. exceso) se ancló a la resina 4-MBHA-poliestireno (209 mg, f=0,98 mmol/g) por activación con DIPCDI (95 μL, 0.61 mmoles, 3 equiv. exceso). Los aminoácidos de la secuencia se introdujeron según un protocolo estándar de síntesis en fase sólida Fmoc/tBu como se ha descrito anteriormente. Una vez la secuencia se completó, se acopló el ácido nonanoico (107,4 μl, 0.61 mmoles, 3 veces de exceso) con DIPCDI/HOBt en la cantidad mínima de DMF. Una vez concluida la reacción según se comprobó por la prueba de Kaiser (con una muestra de resina peptídica), la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y CH2Cl2 (5 x 30 s). Una vez el lipopéptido se completó, el enlace disulfuro se formó por oxidación con yodo (207,6 mg, 4 equiv.) en DMF durante dos horas. La resina se lavó con DMF (8 x 5 mL) y CH2Cl2 (5 x 5 mL).

El desanclaje y desprotección del péptido se realizó por acidólisis con TFA:trietilsilano:agua (95:3:2, v/v/v, 5 mL) durante 1.5 horas a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla acidolítica se evaporó con corriente de N2 y el residuo aceitoso se precipitó con éter etílico seco. El crudo peptídico se recuperó por centrifugación y decantación de la fase etérea. El peso del crudo peptídico fue 245 mg (rendimiento 84%, pureza 85%). Caracterización del péptido purificado: Homogeneidad (por integración del área de la traza de HPLC) >99%; ESI+: m/z 476.5 ([M+3H]3+/3, 100%), 714.0 ([M+2H]2+/2, 73%).

Ejemplo 4

Preparación de nonanoil-Arg-Thr-Arg-ciclo(S-S)[Cys-Arg-DPhe-Leu-Arg-Arq-Cys] (Compuesto (I) con R0 = CH3(CH2)7, R1 = -CH2CH2CH2NHC(=NH)-NH2 (cadena lateral de Arg), R2 = -CH(CH3)OH, R3 = -CH2CH2CH2NHC (=NH)-NH2 (cadena lateral de Arg), R4 = -CH2CH2CH2NHC(=NH)-NH2 (cadena lateral de Arg), R5 = -CH2Ph (cadena lateral de DPhe), R6 = -CH2CH(CH3)2 (cadena lateral de Leu), R7 = -CH2CH2CH2NHC(=NH)-NH2 (cadena lateral de Arg), y R8 = -CH2,CH2NHC(=NH)-NH2 (cadena lateral de Arg); sp-5Arg)

Aminoácidos protegidos: Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-DPhe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH.

Se llevo a cabo la síntesis manual según un protocolo estándar Fmoc/tBu en jeringas de polipropileno con un filtro de polietileno. El primer aminoácido de la secuencia, Fmoc-Cys(Acm)-OH, se ancló directamente a la resina 4-MBHA-poliestireno (151'4 mg, f=0,98 mmol/g). Los aminoácidos de la secuencia se introdujeron según un protocolo estándar de síntesis en fase sólida Fmoc/tBu como se ha descrito anteriormente. Una vez la secuencia se completó, se acopló el ácido nonanoico (78,0 μl, 0,45 mmoles, 3 veces de exceso) con DIPCDI/HOBt en la cantidad mínima de DMF. Una vez concluida la reacción según se comprobó por la prueba de Kaiser (con una muestra de resina peptídica), la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y CH2Cl2 (5 x 30 s). Una vez el lipopéptido se completó, el enlace disulfuro se formó por oxidación con yodo (150,6 mg, 4 equiv.) en DMF durante dos horas. La resina se lavó con DMF (8 x 5 mL) y CH2Cl2 (5 x 5 mL).

El desanclaje y desprotección del péptido se realizó por acidólisis con TFA:TMS-CI:HBr (33% in AcOH): trietilsilano (3,21 ml TFA, 1,29 ml TMS-Cl, 0,25 ml TES, 0,25 ml HBr, volumen total 5 ml) durante 3 horas a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla acidolítica se evaporó con corriente de N2 y el residuo aceitoso se precipitó con éter etílico seco. El crudo peptídico se recuperó por centrifugación y decantación de la fase etérea. El peso del crudo peptídico fue 97.9 mg (rendimiento 80%, pureza 80%). Caracterización del péptido purificado: Homogeneidad (por integración del área de la traza de HPLC) >99%; MALDI-TOF: m/z 1503'63 ([M+H]+, 29.3%), 1525.64 ([M+Na]+, 100%).

Ejemplo 5

Preparación de nonanoil-Dap[(C=NH)-NH2-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Dap[(C=NH)-NH2)]-Dab- Cys](Compuesto (I) con R0 = CH3(CH2)7-, R1 = -CH2NH(C=NH)-NH2 (cadena lateral de Dap [(C=NH)-NH2)]; Dap guanidilado; versión corta de Arq, con dos metilenos menos], R2 = -CH(CH3)OH, R3 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab), R4 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab), R5 = -CH2Ph (cadena lateral de DPhe), R6 = -CH2CH(CH3)2 (cadena lateral de Leu), R7 = -CH2NH(C=NH)-NH2 (cadena lateral de Dap[(C=NH)-NH2], Dap guanidilado), y R8 = -CH2CH2,NH2 (cadena lateral de Dab); sP-2Dap guanidilado)

Aminoácidos protegidos: Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Dab(Z)-OH, Fmoc-Dap(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-DPhe-OH, Fmoc-Dab(Z)-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Dap(Boc)-OH.

Se llevo a cabo la síntesis manual según un protocolo estándar Fmoc/tBu en jeringas de polipropileno con un filtro de polietileno. El primer aminoácido de la secuencia, Fmoc-Cys(Acm)-OH, se ancló directamente a la resina 4-MBHA-poliestireno (126'8 mg, f=0,98 mmol/g). El resto de los aminoácidos de la secuencia se introdujeron según un protocolo estándar de síntesis en fase sólida Fmoc/tBu como se ha descrito anteriormente: Fmoc-Dab(Z)-OH, Fmoc-Dap(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-DPhe-OH, Fmoc-Dab(Z)-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Dab(Z)-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Dap(Boc)-OH. Finalmente, se acopló el ácido nonanoico (65,3 μl, 0,37 mmoles, 3 veces de exceso) con DIPCDI/HOBt en la cantidad mínima de DMF. Una vez concluida la reacción según se comprobó por la prueba de Kaiser (con una muestra de resina peptídica), la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y CH2Cl2 (5 x 30 s). Los grupos Boc de los residuos de Dap se eliminaron por acidólisis con TFA siguiendo las etapas ii) a iv) del protocolo de síntesis Boc. Los grupos amino libres del aminoácidos Dap se guanidilaron con N,N'-di-Boc-N-trifluorometanosulfonil guanidina (486.3 mg, 1.24 mmoles, 5 equiv. de exceso por NH2) en DMF durante cinco días. La ciclación por enlace disulfuro se consiguió por oxidación con yodo (126.2 mg, 4 equiv.) en DMF durante dos horas. La resina se lavó con DMF (8 x 5 mL) y CH2Cl2 (5 x 5 mL).

El desanclaje y desprotección del péptido se realizó por acidólisis con TFA:TMS-Cl:HBr (33% en AcOH):trietil- silano (3.4 mLTFA, 0,2 mL HBr, 0.4 mL anisol total volumen 4 mL) durante 4 horas a 35ºC. La mezcla acidolítica se evaporó con corriente de N2 y el residuo aceitoso se precipitó con éter seco. El crudo peptídico se recuperó por centrifugación y decantación de la fase etérea. El peso del crudo peptídico fue 34.3 mg (rendimiento 22%, pureza 50%). Caracterización del péptido purificado: Homogeneidad (por integración del área de la traza de HPLC) >95%; MALDI-TOF: m/z 1279.54 ([M+H]+, 100%), 1301.29 ([M+Na]+, 50,3%), 1317.25 ([M+K]+, 5.5%).

Ejemplo 6

Preparación de ciclo(S-S)[DCys-DDab-DArq-DLeu-Phe-DDab-DCys] DDab DThr-DArg-octilamida of sP-retroenantio 2Arg (Compuesto de fórmula (I') con R0 = CH3CH2 )7-, R1 = -CH2CH2CH2,NHC(=NH)-NH2 (cadena lateral de DArq), R2 = -CH(CH3)OH, R3 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de DDab), R4 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de DDab) R5 = -CH2Ph (cadena lateral de Phe), R6 = -CH2CH(CH3)2 (cadena lateral de DLeu), R7 = -CH2CH2CH2NHC(=NH)-NH2 (cadena lateral de DArg), y R8 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de DDab); sP-retroenantio 2Arg)

Aminoácidos protegidos: Boc-DArg(Z2)-OH, Boc-DThr(Bzl)-OH, Boc-DDab(Z)-OH Boc-DCys(Acm)-OH, Fmoc-Phe-OH, Boc-DLeu-OH.

Se llevo a cabo la síntesis manual según un protocolo estándar Boc en jeringas de polipropileno con un filtro de polietileno. Se introdujo en primer lugar un aminoácido de referencia (Gly). Fmoc-Gly-OH (174 mg, 0.59 mmoles, 3 equiv. exceso), se ancló a la resina 4-MBHA-poliestireno (200 mg, f=0,98 mmol/g) por reacción con DIPCDI (91 μl, 0,59 mmoles, 3 veces de exceso) y HOBt (91 mg, 0.59 mmoles, 3 equiv. exceso). El grupo Fmoc se eliminó por tratamiento con solución de 20% piperidina en DMF (2 x 10 min). La resina se lavó con DMF (5 x 30 s). A continuación, se introdujo el espaciador ("linker") ácido 4-hydroxifenilpropiónico (97.7 mg, 0.59 mmoles, 3 equiv. exceso) en la resina aminoacílica por reacción con DIPCDI (91 μl, 0,59 mmoles, 3 veces de exceso) y HOBt (91 mg, 0.59 mmoles, 3 equiv. exceso) en la cantidad mínima de DMF. La resina se dejó toda la noche con solución de 20% piperidina en DMF y posteriormente se lavó con DMF (5 x 30s). El primer aminoácido de la secuencia, Boc-DArg(Z2)-OH (319 mg, 0.59 mmoles, 3 equiv. exceso) se esterificó al espaciador ("linker") con DIPCDI (91 μl, 0.59 mmoles, 3 equiv. exceso) y DMAP (7.18 mg, 0.059 mmoles, 0.3 equiv.). Esta etapa se repitió dos veces. El resto de los aminoácidos de la secuencia de Thr a Cys, se introdujeron según un protocolo estándar de síntesis Boc como se ha descrito anteriormente. Una vez la secuencia se completó, el enlace disulfuro se formó por oxidación con yodo (198.98 mg, 0.78 mmol, 4 equiv.) en DMF durante dos horas. La resina se lavó con DMF (8 x 5 mL) y CH2Cl2 (5x5 mL). El péptido se desancló de la resina por aminolisis con octilamina (28.4 μL, 0.19 mmol, 1 equiv.) en DMF durante la noche. Se filtró la solución y el disolvente se elimino al rotavapor. El residuo aceitoso se trituró con acetonitrilo. Se obtuvo un sólido blanco.

La desprotección de las cadenas laterales se realizó por acidólisis con TFA:HBr (33% en AcOH):tioanisol (85:5:10) durante 3 horas a 35ºC. La mezcla acidolítica se evaporó con corriente de N2 y el residuo aceitoso se precipitó con éter seco. El crudo peptídico se recuperó por centrifugación y decantación de la fase etérea. El peso del crudo peptídico fue 90 mg (rendimiento 35%, pureza 50% por presencia de restos de tioanisol y de la sal de bencilsulfonio del tioanisol). Caracterización del péptido purificado: Homogeneidad (por integración del área de la traza de HPLC) >99%; MALDI-TOF: m/z 1308.21 ([M+H]+, 100%), 1330.20 ([M+Na]+, 23%).

Ejemplo 7

Preparación de ciclo(S-S)[DCys-DDab-DDab-DLeu-Phe-DDab-DCys]DDab-DThr-DDab-octilamida (Compuesto de fórmula (I') con R0 = CH3CH2)7-, R1 = CH2CH2NH2 (cadena lateral de DDab), R2 = -CH(CH23)OH, R3 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de DDab), R4 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de DDab), R5 = -CH2Ph (cadena lateral de Phe), R6 = -CH2CH(CH3)2 (cadena lateral de DLeu), R7 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de DDab), y R8 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de DDab); sP-B retroenantio)

Aminoácidos protegidos: Boc-DDab(Z)-OH, Boc-DThr(Bzl)-OH, Boc-DCys(Acm)-OH, Fmoc-Phe-OH, Boc- DLeu-OH.

Se llevo a cabo la síntesis manual según un protocolo estándar Boc en jeringas de polipropileno con un filtro de polietileno como se describe en el Ejemplo 6, partiendo de resina 4-MBHA-poliestireno (200 mg, f=0,98 mmol/g). El peso del crudo peptídico fue 190 mg (rendimiento 80%, pureza 40% por presencia de restos de tioanisol y de la sal de bencilsulfonio del tioanisol). Caracterización del péptido purificado: Homogeneidad (por integración del área de la traza de HPLC) >95%; MALDI-TOF: m/z 1196.15 ([M+H]+, 100%), 1218.07 ([M+Na]+, 87.2%).

Ejemplo 8

Preparación de nonanoil-Arg-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Arg-Dab-Cys]-Gly-NHCH2CH2CH2NHCH2 CH2CH2CH2NHCH2CH2CH2NH2 (Compuesto de fórmula (I) con R0 = CH3(CH2)7-, R1 = -CH2CH2CH2NHC(=NH)-NH2 (cadena lateral de Arg), R2 = -CH(CH3)OH, R3 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab), R4 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab), R5 = -CH2Ph (cadena lateral de DPhe), R6 = -CH2CH(CH3)2 (cadena lateral de Leu), R7 = -CH2CH2CH2NHC(=NH)-NH2 (cadena lateral de Arg), y R8 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab); sP-2Arg-espermida)

Aminoácidos protegidos: Fmoc-Ala-OH, Boc-Gly-OH, Boc-Cys(Acm)-OH, Boc-Dab(Z)-OH, Boc-Arg(Z2)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-DPhe-OH.

Se introdujo en primer lugar un aminoácido de referencia (Ala). Fmoc-Ala-OH (167 mg, 0.54 mmoles, 3 equiv. exceso), se ancló a la resina 4-MBHA-poliestireno (113 mg, f=0,98 mmol/g) por reacción con DIPCDI (83.5 μl, 0,54 mmoles, 5 veces de exceso) y HOBt (82'5 mg, 0.54 mmoles, 5 equiv. exceso). El grupo Fmoc se eliminó por tratamiento con solución de 20% piperidina en DMF (2 x 10 min.). La resina se lavó con DMF (5 x 30 s). A continuación, se introdujo el espaciador ("linker") ácido 4-hydroxifenilpropiónico (97.7 mg, 0.59 mmoles, 3 equiv. exceso) en la resina aminoacílica por reacción con DIPCDI (50 μl, 0,32 mmoles, 3 veces de exceso) y HOBt (49'5 mg, 0.32 mmoles, 3 equiv. exceso) en la cantidad minima de DMF. La resina se dejó toda la noche con solución de 20% piperidina en DMF. El primer aminoácido de la secuencia, Boc-Gly-OH (188.86 mg, 1'08 mmoles, 10 equiv. exceso) se esterificó al espaciador ("linker") con DIPCDI (167 μl, 1'08 mmoles, 10 equiv. exceso) y DMAP (13.16 mg, 0.108 mmoles, 1 equiv.). El resto de los aminoácidos de la secuencia de Cys a Arg, se introdujeron según un protocolo estándar de síntesis Boc como se ha descrito anteriormente. Finalmente, se acopló el ácido nonanoico (94'3 μl, 0,53 mmoles, 5 veces de exceso) con DIPCDI/HOBt en la cantidad mínima de DMF. Una vez la secuencia se completó, el enlace disulfuro se formó por oxidación con yodo (99 mg, 4 equiv.) en DMF durante dos horas. La resina se lavó con DMF (8 x 5 mL) y CH2Cl2 (5 x 5 mL). El péptido se desancló de la resina por aminolisis con espermina (259.5 μL, 0.32 mmole, 3 equiv. de exceso) en DMF durante la noche. Se filtró la solución y el disolvente se elimino al rotavapor. El residuo aceitoso se trituró con acetonitrilo. Se obtuvo un sólido blanco.

La desprotección de las cadenas laterales se realizó por acidólisis con TFA:HBr (33% en AcOH):anisol (85:5:10) durante 3 horas a 35ºC. La mezcla acidolítica se evaporó con corriente de N2 y el residuo aceitoso se precipitó con éter seco. El crudo peptídico se recuperó por centrifugación y decantación de la fase etérea. El peso del crudo peptídico fue 191 mg (rendimiento cuantitativo, pureza 50%). Caracterización del péptido purificado: Homogeneidad (por integración del área de la traza de HPLC) >98%; MALDI-TOF: m/z 1578.18 ([M+H]+, 100%), 1600.16 ([M+Na]+, 37%).

Los péptidos siguientes:

Nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)fCys-Dab-(D)Phe-Leu-Dab-Dab-Cys] (Compuesto de fórmula (I) con R0 = CH3(CH2)7-, R1 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de f Dab), R2 = -CH(CH3)OH, R3 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab), R4 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab), R5 = -CH2Ph (cadena lateral de DPhe), R6 = -CH2CH(CH3)2 (cadena lateral de Leu), R7 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab), R8 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab) (spB);

Nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-(D)Phe-Dab-Leu-Dab-Cys] (Compuesto de fórmula (I) con R0 = CH3(CH2)7-, R1 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab), R2 = -CH(CH3)OH, R3 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab), R4 = CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab), R5 = -CH2Ph (cadena lateral de DPhe), R6 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab), R7 = CH2CH(CH3)2 (cadena lateral de Leu),y R8 = CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab) (sp-C); y

Nonanoil-Dap-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-(D)Phe-Leu-Dap-Dab-Cys] (Compuesto de fórmula (I) con R0 = CH3(CH2)7, R1 = CH2NH2 (cadena lateral de Dap), R2 = -CH(CH3)OH, R3 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab), R4 = CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab), R5 = CH2Ph (cadena lateral de DPhe), R6 = CH2CH(CH3)2 (cadena lateral de Leu), R7 = -CH2NH2 (cadena lateral de Dap), y R8 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab) sP-D);

son conocidos y se pueden preparar tal y como se describe en la siguiente publicación científica: Adriá Clausell et al., "Gram negative bacteria outer y inner membrane models: Insertion of cyclic cationic peptides" J. Phys. Chem B, 2007, vol. 111, pp. 551-563.

Nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Met-Dab- Dab-Cys (Compuesto de fórmula (I) con R0 = CH3(CH2)7-, R1 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab), R2 = -CH(CH3)OH, R3 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab], R4 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab), R5 = -CH2Ph (cadena lateral de DPhe), R6 = CH2CH2SCH3 (cadena lateral de Met), R7 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab), y R8 = -CH2CH2NH2 (cadena lateral de Dab]; sp-Met) es también conocido y se pueden preparar como se describe en el Ejemplo 9.

Ejemplo 9

Preparación del péptido sP-Met

Aminoácidos protegidos: Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Dab(Boc)-OH, Fmoc-Dap(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-DPhe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH.

Se llevó a cabo la síntesis manual según un protocolo estándar Fmoc/tBu en jeringas de polipropileno con un filtro de polietileno. El primer aminoácido de la secuencia, Fmoc-Cys(Acm)-OH, se ancló directamente a la resina 4-MBHA-poliestireno (113,7 mg, f=0,98 mmol/g) por activación con DIPCDI (52 μL, 0.33 mmoles, 3 equiv. exceso). Los aminoácidos de la secuencia se introdujeron según un protocolo estándar de síntesis en fase sólida Fmoc/tBu como se ha descrito anteriormente. Una vez la secuencia se completó, se acopló el ácido nonanoico (58,5 μl, 0,33 mmoles, 3 veces de exceso) con DIPCDI/HOBt en la cantidad mínima de DMF. Una vez concluida la reacción según se comprobó por la prueba de Kaiser (con una muestra de resina peptídica), la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y CH2Cl2 (5 x 30 s). Una vez el lipopéptido se completó, el enlace disulfuro se formó por oxidación con yodo (113,1 mg, 4 equiv.) en DMF durante dos horas. La resina se lavó con DMF (8 x 5 mL) y CH2Cl2 (5 x 5 mL).

El desanclaje y desprotección del péptido se realizó por acidólisis con TFA:TMS-Cl:trietilsilano (2,77 mL TFA, 1,03 mL TMS-Cl, 0,2 mL TES, volumen total 4 mL) durante 3 horas a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla acidolítica se evaporó con corriente de N2 y el residuo aceitoso se precipitó con éter seco. El crudo peptídico se recuperó por centrifugación y decantación de la fase etérea. El peso del crudo peptídico fue 109,7 mg (rendimiento 79'3%, pureza 75%). Caracterización del péptido purificado: Homogeneidad (por integración del área de la traza de HPLC) >99%; MALDI-TOF: m/z 1241,62 ([M+H]+, 59,4%), 1263,68 ([M+Na]+, 100%).

Ejemplo 10

Preparación del péptido sP-Met(O)

Aminoácidos protegidos: Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Dab(Boc)-OH, Fmoc-Dap(Boc)-OH, Fmoc-Met(0)-OH, Fmoc-DPhe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH.

Se llevó a cabo la síntesis manual según un protocolo estándar Fmoc/tBu en jeringas de polipropileno con un filtro de polietileno. El primer aminoácido de la secuencia, Fmoc-Cys(Acm)-OH, se ancló directamente a la resina 4-MBHA-poliestireno (112,7 mg, f=0,98 mmol/g) por activación con DIPCDI (51'3 μL, 0.33 mmoles, 3 equiv. exceso). Los aminoácidos de la secuencia se introdujeron según un protocolo estándar de síntesis en fase sólida Fmoc/tBu como se ha descrito anteriormente. Una vez la secuencia se completó, se acopló el ácido nonanoico (58,0 μl, 0,33 mmoles, 3 veces de exceso) con DIPCDI/HOBt en la cantidad mínima de DMF. Una vez concluida la reacción según se comprobó por la prueba de Kaiser (con una muestra de resina peptídica), la resina se lavó con DMF (5 x 30 s) y CH2Cl2 (5 x 30 s). Una vez el lipopéptido se completó, el enlace disulfuro se formó por oxidación con yodo (112,1 mg, 4 equiv.) en DMF durante dos horas. La resina se lavó con DMF (8 x 5 mL) y CH2Cl2 (5 x 5 mL).

El desanclaje y desprotección del péptido se realizó por acidólisis con TFA:trietilsilano (95:5, v/v, 4 mL) durante 3 horas a 45ºC. A continuación, la mezcla acidolítica se evaporó con corriente de N2 y el residuo aceitoso se precipitó con éter seco. El crudo peptídico se recuperó por centrifugación y decantación de la fase etérea. El peso del crudo peptídico fue 43,5 mg (rendimiento 31'4%, pureza 80%). Caracterización del péptido purificado: Homogeneidad (por integración del área de la traza de HPLC) >99%; MALDI-TOF: m/z 1257,84 ([M+H]+, 100%), 1279,84 ([M+Na]+, 95,0%).

Ejemplo 11

Test de actividad antibacteriana

La actividad antibacteriana de los Iipopéptidos sintéticos se determinó en placas estériles de 96 pocillos (Corning Costar 3598 microtiter plates) con un volumen final de 200 μL como se indica a continuación: alícuotas (100 μL) de una suspensión de bacterias a una concentración de 105 unidades formadoras de colonias/mL en medio de cultivo (MH, Muller Hinton Broth, Difco, USA) a pH 7.4, se adicionaron a 100 μL de solución de lipopéptido preparada a partir de una disolución madre en agua de 1 mg/mL, en diluciones seriadas a doble dilución en MH a pH 7.4 (Jorgensen & Turnide, 2003). La inhibición de crecimiento bacteriano se determinó a partir de la absorbancia a 492 nm en un instrumento Absorbance Microplate reader ELx 800 (Bio-tek Instruments) tras incubación a 37ºC durante 18-20 h. La actividad antibacteriana se expresó como CMI, la concentración a la cual no se detecta crecimiento tras las 18-20 h de incubación.

Los microorganismos se cultivaron en Tryptycase Soy Broth (Pronadisa, Barcelona), incubando a 37ºC hasta observar crecimiento bacteriano. A continuación, se sembraron en Trypticase Soy Agar (Pronadisa, Barcelona) y se incubaron a 37ºC hasta observar la formación de colonias. Los microorganismos se conservaron en criobolas (EAS laboratoire, France) a -20ºC.

Las cepas de las bacterias usadas para llevar a cabo el test de actividad antibacteriana se obtuvieron de: the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA):

Escherichia coli ATCC 8739

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

Salmonella typhimurium ATCC14028

Staphylococcus aureus ATCC 6538

Bacillus cereus var. mycoides ATCC11778

Mycobacterium phlei ATCC41423

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Los resultados se muestran en la Tabla 1 y en la Tabla 2.

TABLA 1
Actividad antibacteriana (CMI) en Gram positivos expresada en μg/ml

TABLA 2
Actividad antibacteriana (CMI) en Gram negativos expresada en μg/ml

Control (polimixina B): (S)-6-metiloctanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo[Dab-Dab-DPhe- Leu-Dab-Dab-Dab].

Estos resultados demuestran que los compuestos (I) y (I') muestran actividad antibacteriana a nivel micromolar tanto contra bacterias Gram-positivas como contra bacterias Gram-negativas (en este último caso, la CMI es ligeramente superior a la de la polimixina natural, pero la polimixina no muestra actividad contra bacterias Gram-positivas). En consecuencia, los nuevos compuestos presentan un espectro de actividad superior puesto que los antibióticos peptídicos disponibles (polimixina natural y daptomicina) son sólo activos contra un tipo de bacteria, Gram-negativas o Gram-positivas, respectivamente.




Reivindicaciones:

1. Compuesto de fórmula (I),


o un retroenantiómero del mismo de fórmula (I'),


donde:

R0 es un radical seleccionado entre el grupo que consiste en:

CH3-(CH2)m-,

CH3-O-(CH2CH2O)2CH2-, y

m es un entero entre 7 y 10;

x es un entero entre 1 y 3;

R1, R3, R4, R7, y R8 son radicales seleccionados independientemente que tienen la fórmula siguiente:

GF-(CH2)n-;

donde

n es un entero entre 1 y 4; y GF es un radical seleccionado entre el grupo que consiste en -NH2, -NH-C(=NH)-NH2 y 4-imidazolilo;

R2 es un radical seleccionado entre el grupo que consiste en -CH(CH3)(OH), -CH(CH3)2, -CH2NH2 y -CH2OH;

R5 y R6 son radicales seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en -(C1-C4)-alquilo lineal o ramificado, -(CH2)-R10, -CH2-CH2-S-CH3 y -CH2-CH2-S(=O)-CH3;

R9 es H ó Gly-NHCH2CH2CH2NHCH2CH2CH2CH2NHCH2CH2CH2NH2; y

R10 es un radical seleccionado entre el grupo que consiste en fenilo, 3-indolilo, 4-imidazolilo, 4-hidroxifenilo, α o β-naftilo y 2-, 3- o 4-piridilo;

con la condición de que el compuesto de fórmula (I) no es uno de los siguientes compuestos:

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Cys];

nonanoil-Dap-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Dap-Dab-Cys];

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Met-Dab-Dab-Cys];

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Met(0)-Dab-Dab-Cys]; o

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DTrp-Leu-Dab-Dab-Cys].

2. Compuesto según la reivindicación 1, donde R2 es -CH(CH3)(OH).

3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que es el compuesto de fórmula (I).

4. Compuesto según la reivindicación 3, que se selecciona de entre los siguientes:

nonanoil-Arg-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Arg-Dab-Cys];

nonanoil-Arg-Thr-Arg-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Arg- Dab-Cys];

nonanoil-Arg(NO2)-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Arg(NO2)-Dab-Cys];

nonanoil-Arg-Thr-Arg-ciclo(S-S)[Cys-Arg-DPhe-Leu-Arg-Arg-Cys];

nonanoil-Dap[(C=NH)-NH2]-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Dap[(C=NH)-NH2]-Dab-Cys]; y

nonanoil-Arg-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Arg-Dab-Cys]-Gly-NHCH2CH2CH2NHCH2CH2CH2CH2 NHCH2CH2CH2NH2.

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que es el compuesto de fórmula (I').

6. Compuesto según la reivindicación 5, que se selecciona de entre los siguientes:

ciclo(S-S)[DCys-DDab-DArg-DLeu-Phe-DDab-DCys]DDab-DThr-DArg-octilamida; y

ciclo(S-S)[DCys-DDab-DDab-DLeu-Phe-DDab-DCys]DDab-DThr-DDab-octilamida.

7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o uno de los siguientes compuestos:

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Cys];

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Dab-Leu-Dab-Cys];

nonanoil-Dap-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Dap-Dab-Cys];

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Met-Dab-Dab-Cys];

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Met(0)-Dab-Dab-Cys]; o

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DTrp-Leu-Dab-Dab-Cys];

para su uso como agente antibacteriano contra bacterias Gram-positivas.

8. Compuesto según la reivindicación 7, donde las bacterias Gram-positivas se seleccionan entre el grupo que consiste en Micobacterium phlei, Staphylococcus aureus y Bacillus cereus var. mycoides.

9. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para uso como agente antibacteriano contra bacterias Gram-negativas.

10. Compuesto según la reivindicación 9, donde las bacterias Gram-negativas se seleccionan entre el grupo que consiste en Salmonella tvphimurium, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli.

11. Uso de un compuesto coma se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o uno de los siguientes compuestos,

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Cys];

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Dab-Leu-Dab-Cys];

nonanoil-Dap-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Leu-Dap-Dab-Cys];

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Met-Dab-Dab-Cys];

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DPhe-Met(0)-Dab-Dab-Cys]; y

nonanoil-Dab-Thr-Dab-ciclo(S-S)[Cys-Dab-DTrp-Leu-Dab-Dab-Cys];

para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una infección bacteriana causada por bacterias Gram-positivas en un mamífero, incluyendo un humano.

12. Uso según la reivindicación 11, donde las bacterias Gram-positivas se seleccionan entre el grupo que consiste en Micobacterium phlei, Staphylococcus aureus y Bacillus cereus var. mycoides.

13. Uso de un compuesto como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una infección bacteriana causada por bacterias Gram-negativas en una mamífero, incluyendo un humano.

14. Uso según la reivindicación 13, donde las bacterias Gram-negativas se seleccionan entre el grupo que consiste en Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli.

15. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, junto a excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.






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