Composiciones y métodos para modular la hemostasia.

Una variante del Factor Xa que modula la hemostasia, que comprende los aminoácidos 41 a 179 y los aminoácidos 235 a 488 de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la Figura 5

, y que comprende al menos una mutación por sustitución, en donde dicha al menos una mutación por sustitución incluye la sustitución de Ile en la posición 235 con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Leu, Phe, Asp o Gly

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2006/060927.

Solicitante: THE CHILDREN'S HOSPITAL OF PHILADELPHIA.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 34TH STREET & CIVIC CENTER BOULEVARD PHILADELPHIA, PA 19104 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: CAMIRE,RODNEY M.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/64 (que provienen de tejido animal, p. ej. renina)

PDF original: ES-2496567_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Composiciones y métodos para modular la hemostasia Campo de la invención

La presente invención se refiere a los campos de la medicina y la hematología. Más específicamente, la invención proporciona nuevos agentes del Factor X/Xa de coagulación y métodos para utilizarlos para modular la cascada de coagulación en pacientes que lo necesiten.

Antecedentes de la invención

A lo largo de la memoria descriptiva se citan diversas publicaciones y documentos con el fin de describir el estado de la técnica relacionado con esta invención.

Las enzimas de coagulación son enzimas de tipo tripsina que pertenecen a la familia de proteasas S1 peptidasas que contienen un pliegue de tipo quimotripsina. Las proteasas de coagulación contienen dominios catalíticos que son muy homólogos entre sí y con las serina proteasas de digestión ancestrales. La homología/identidad estructural es tan grande (>7 %) que los restos en los dominios catalíticos de las enzimas de coagulación se numeran de acuerdo con los restos correspondientes en el quimotripsinógeno.

Las enzimas de coagulación circulan en la sangre como precursores inactivos, zimógenos, que requieren escisión proteolítica para su activación. Los zimógenos poseen actividad proteolítica de ~1. veces o menor cuando se compara con las serina proteasas producidas tras la activación. El inicio de la coagulación en el sitio del daño vascular da lugar a una serie de reacciones en las que un zimógeno se convierte en una proteasa a través de escisión proteolítica específica y forma la enzima para la reacción posterior. Esto culmina en la activación de los glóbulos y en la conversión de fibrinógeno soluble en fibrina insoluble y, por tanto, en la formación del coágulo. El exceso de proteasas se elimina por reacción con inhibidores de proteasa circulantes que actúan como sustratos "suicidas" o aquellos que reconocen las enzimas activas. Por tanto, la activación proteolítica de los zimógenos de coagulación es una característica reguladora clave de la cascada de coagulación.

Camire R., (J. Biol. Chem., vol 277, no. 4, 22) desvela la sustitución de Tyr225 en el Factor Xa por Pro para disminuir la sensibilidad a la unión con Na+. El Factor Xa resultante mostró que un puente salino parcialmente desestabilizado (lie16- Asp194), era más de tipo zimógeno, y poseía una capacidad disminuida para unir el Factor Va.

Aunque algunos de los zimógenos de coagulación se escinden en dos o más sitios en sus respectivas reacciones de activación, la formación de la proteasa requiere la escisión en un solo sitio. La escisión en este sitio y sus consecuencias estructurales se consideran de la forma más simple utilizando el sistema de numeración homólogo basado en el quimotripsinógeno y en el exhaustivo trabajo estructural realizado con el tripsinógeno y la tripsina. La conversión del zimógeno en serina proteasa requiere escisión después de Arg15 (normalmente, la unión entre Arg15e lie16) que generalmente elimina un péptido de activación y expone un nuevo extremo N en el dominio catalítico que comienza con lie16. Un ejemplo es la conversión del factor X al factor Xa (véanse las figuras 1 y 2). En la tripsina y el factor Xa, la nueva secuencia N-terminal empieza con lle16-Val17-Gly18-Gly19. En el caso de otras enzimas coagulantes, la nueva secuencia N-terminal es una variación sobre el mismo tema. Después, la secuencia N- terminal se pliega hacia atrás en el dominio catalítico y se inserta en la hendidura de unión N-terminal de una forma específica de secuencia que denomina "sexualidad molecular". Véase la Figura 2. Por consiguiente, no es probable que variantes con secuencias N-terminal experimenten sexualidad molecular de una forma comparable. La inserción N-terminal da lugar a la formación de un puente salino entre el grupo a-NH2de lie16 y Asp194 en el interior del dominio catalítico. La formación del puente salino está asociada a numerosos cambios en la estructura del dominio catalítico, incluyendo: reordenamientos de los denominados dominios de activación, mostrados en la Figura 3; formación del orificio de oxianión requerido para la catálisis y la formación de un sitio de unión a sustratos. Estos cambios dan lugar a la maduración de la serina proteasa activa. La aportación principal de las interacciones específicas de secuencia del nuevo extremo N durante la sexualidad molecular y la formación del puente salino a la maduración de la proteasa activa son evidentes a partir de los siguientes hechos: las proteasas bacterianas que no requieren la escisión para la activación utilizan otra cadena lateral dentro del dominio catalítico hacia el puente salino con Asp194; el tripsinógeno puede activarse en una configuración de tipo proteinasa sin escisión, pero con concentraciones extremadamente elevadas de un dipéptido lle-Val que se inserta en la hendidura, aunque de forma muy ineficaz; el dipéptido Val-lie y otras variantes son mucho menos eficaces; asimismo, hay dos ejemplos de proteínas bacterianas que activan zimógenos de coagulación en ausencia de escisión trastocando el mecanismo de activación proporcionando su propio extremo N que se inserta en la hendidura de unión N-terminal.

Los cambios estructurales descritos anteriormente proporcionan una explicación molecular para la conversión de un zimógeno precursor en una serina proteasa activa. Sin embargo, a diferencia de la tripsina, que es totalmente activa después de la escisión en Arg15, muchas de las enzimas de coagulación actúan muy pobremente sobre sus sustratos de proteína. A pesar de que generalmente poseen sitios activos totalmente funcionales y de que pueden escindir pequeños substratos de peptidil, la escisión eficaz del sustrato biológico a menudo requiere una proteína

cofactor (Figura 2). En estos casos, las proteínas cofactores aumentan la velocidad de escisión de sustratos de proteínas en varios miles de veces. Aunque el mecanismo mediante el cual funcionan las proteínas cofactores sigue sin resolverse, es improbable que funcionen haciendo que la proteasa sea más de tipo enzima y, por lo tanto, más eficaz. Un aspecto fundamental es que, con una excepción, los cofactores unen selectivamente la proteasa y no el zimógeno correspondiente. Por ejemplo, el factor Xa se une con gran afinidad al Fva unido a la membrana, mientras que el zimógeno del factor X no se une al FVa.

Dependiendo del estado del paciente, puede que sea aconsejable desarrollar proteínas de la cascada de coagulación alteradas que posean una función de coagulación mejorada o reducida. Un objetivo de la invención es proporcionar dichas proteínas para su uso como terapia.

Sumario de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan composiciones y métodos para influir en sitios reguladores en la ruta de transición de zimógeno FX->proteasa impulsando así la producción de una especie FXa más de "tipo zimógeno". Las composiciones y métodos de la invención son eficaces para modular la hemostasia en pacientes que lo necesiten.

En una realización, se proporciona una variante del Factor Xa que modula la hemostasia que comprende los aminoácidos 41 a 179 y los aminoácidos 235 a 488 de la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Figura 5, y que comprende al menos una mutación por sustitución, en la que dicha mutación por sustitución incluye la sustitución del lie en la posición 235 por un aminoácido seleccionado del grupo formado por Leu, Phe, Asp o Gly.

La variante del Factor Xa de acuerdo con la invención puede comprender asimismo una mutación por sustitución en la Val en la posición 236 o en el Asp en la posición 418 de la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Figura 5; preferentemente en el que la Val en la posición 236... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una variante del Factor Xa que modula la hemostasia, que comprende los aminoácidos 41 a 179 y los aminoácidos 235 a 488 de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la Figura 5, y que comprende al menos una mutación por sustitución, en donde dicha al menos una mutación por sustitución incluye la sustitución de lie en la posición 235 con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Leu, Phe, Asp o Gly.

2. La variante del Factor Xa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la lie en la posición 235 se sustituye con Leu.

3. La variante del Factor Xa tal como se reivindica en la reivindicación 1, que además comprende una mutación por sustitución en la Val en la posición 236 o en el Asp en la posición 418.

4. La variante del Factor Xa de la reivindicación 3, en donde

a) la Val en la posición 236 es Leu, Ala, o Gly; o

b) el Asp en la posición 418 es Asn o Glu.

5. La variante del Factor Xa de la reivindicación 1, en donde la secuencia en las posiciones 235 a 237 es Leu-Val- Gly.

6. La variante del Factor Xa de la reivindicación 1, en donde al menos dicha mutación por sustitución consiste en la sustitución de la lie en la posición 235 con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Leu, Phe, Asp y Gly.

7. La variante del Factor Xa de la reivindicación 1, en donde la variante del Factor Xa tiene una semivida plasmática más larga que la del Factor Xa de tipo silvestre, en donde dicho Factor Xa de tipo silvestre consiste en los aminoácidos 41 a 179 y 235 a 488 de la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Figura 5.

8. Una variante del Factor Xa que modula la hemostasia, que consiste en los aminoácidos 41-179 y en los aminoácidos 235-488 de la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Figura 5 y que comprende al menos una mutación por sustitución, en donde dicha al menos una mutación por sustitución incluye la sustitución de la lie en la posición 235 con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Leu, Phe, Asp y Gly.

9. Una variante del Factor Xa que consiste en los aminoácidos 41 -179 y en los aminoácidos 235-488 de la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Figura 5, en donde la lie en la posición 235 de la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Figura 5 (posición 16 en la numeración de quimotripsina) se cambia a Leu.

1. Una composición farmacéutica que comprende la variante del Factor Xa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en un vehículo biológicamente compatible.

11. Una variante del Factor Xa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en donde la unión de sustratos mediante el sitio activo de dicha variante del Factor Xa es menor en comparación con el Factor Xa de tipo silvestre y aumenta cuando dicha variante del Factor Xa está unida por el Factor Va en el complejo de protrombinasa, en donde dicho Factor Xa de tipo silvestre consiste en los aminoácidos 41 a 179 y 235 a 488 de la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Figura 5.

12. La variante del Factor Xa de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso en el tratamiento de un trastorno relacionado con hemostasia.

13. La variante del Factor Xa para el uso de la reivindicación 12, en donde dicho trastorno se selecciona del grupo que consiste en hemofilia A, hemofilia B, deficiencia del factor de coagulación, hemorragia asociada a lesión, traumatismo, trombosis, trombocitopenia, ictus, coagulopatía y coagulación intravascular diseminada (CID).

14. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la variante del Factor Xa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha secuencia de ácido nucleico también codifica un sitio de escisión proteolítica intracelular, en donde dicho sitio de escisión proteolítica intracelular está entre las posiciones 234 y 235 de la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Figura 5, o sustituye el péptido de activación.

15. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de Factor X (FX) humano, en donde dicho polipéptido del FX comprende al menos una mutación por sustitución en los aminoácidos 41 a 179 y 235 a 488 de la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Figura 5, incluyendo dicha al menos una mutación por sustitución la sustitución de lie en la posición 235 con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Leu, Phe, Asp, y Gly, y en la que dicha secuencia de ácido nucleico codifica un sitio de escisión proteolítica intracelular, en donde dicho sitio de escisión proteolítica intracelular está entre las

posiciones 234 y 235 de la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Figura 5, o sustituye el péptido de activación.

16. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 15, en donde la lie en la posición 235 se sustituye con Leu.

17. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 15, en donde dicho polipéptido del FX también comprende al menos una mutación por sustitución en la Val en la posición 236 o en el Asp en la posición 418 de la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Figura 5.

18. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 17, en donde el polipéptido del Factor X también comprende al menos una modificación seleccionada del grupo que consiste en:

a) la Val en la posición 236 es Leu, Ala o Gly; y

b) el Asp en la posición 418 es Asn o Glu.

19. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 15, en donde dicho polipéptido del FX comprende una secuencia propéptido.

2. La molécula de ácido nucleico de las reivindicaciones 14 o 15, en donde dicho sitio de escisión proteolítica intracelular es un sitio de escisión PACE/furina.

21. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 2 unido operativamente a una secuencia reguladora.

22. El vector de expresión de la reivindicación 21, seleccionado del grupo que consiste en un vector adenoviral, un vector de adenovirus asociado, un vector retroviral, un plásmido y un vector lentiviral.

23. Una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 2 unida operativamente a una secuencia reguladora.

24. La célula hospedadora de la reivindicación 23, en donde dichas células hospedadoras son células CHO.

25. Un método para producir Factor X activado (FXa) que comprende incubar la célula hospedadora de las reivindicaciones 23 o 24 y purificar el FXa producido de este modo.

26. El FXa producido de acuerdo con el método de la reivindicación 25.

27. Un Factor X activado (FXa) obtenido mediante la escisión proteolítica del polipéptido del Factor X codificado por la secuencia de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 2.