Cepas de Agrobacterium desarmadas, plásmidos Ri y procedimientos de transformación basados en ellas.

Un procedimiento para producir una célula de planta transgénica que comprende las etapas de:

a) proporcionar bacterias de una variante de cepa no patógena transgénica de la cepa K599 de Agrobacterium

(NCPPB 2659) que es una bacteria patógena de las plantas transmitida por la tierra caracterizada por una secuencia intergénica de ARNr 16S-23S que comprende al menos un motivo de secuencia seleccionado del grupo que consiste en los motivos de secuencia descritos por SEC ID Nº: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14, en el que dicha variante de cepa es capaz de infectar células vegetales, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas y en el que dicha variante de cepa comprende además una variante de plásmido no patógeno del plásmido Ri pRi2659 y un ADN-T transgénico, y

b) co-cultivar una célula de planta con dichas bacterias, y

c) aislar o seleccionar células vegetales que comprenden establemente integrado en su genoma dicho ADN-T transgénico,

en el que dicha variante de cepa no patógena es capaz de infectar células vegetales, para mediar en la transferencia de ADN-T en células vegetales, y para mediar en la inserción de ADN-T en el genoma de la planta, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas y

en el que la variante de plásmido no patógeno comprende al menos una secuencia que tiene una identidad de secuencias de al menos el 90 % con una secuencia como se describe por SEC ID Nº: 24.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2005/009366.

Solicitante: BASF PLANT SCIENCE GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: 67056 LUDWIGSHAFEN ALEMANIA.

Inventor/es: BROWN,JEFFREY A, MANKIN,LUKE, HILL,DWIGHT-STEVEN, OLHOFT,PAULA, TOREN,EFFIE, XING,LIQUN, FU,HUIHUA, IRELAND,LESLEY, JIA,HONGMEI, SONG,HEE-SOOK, WENCK,ALLAN RICHARD, NEA,LARRY.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/82 (para células vegetales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/415 (de vegetales)

PDF original: ES-2543086_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

de ¡os dibujos

Fig. 1A Dendrograma que demuestra la relación de cepas de Agroóacfer/a como se ha determinado por RAPD (ADN polimórfico amplificado al azar) (Figura 2 de Llob 2003). Para la descripción de las diversas cepas véase la Tabla 1 a continuación. La cepa K599 de Agroóacfenum (NCPPB 2659) bajo estas condiciones se agrupa en un grupo distinto de cultivares separado de las cepas de "Agroóacfer/um fume/ac/ens" tradicionales tales como C58 o Ach5, pero también de otras cepas de "Agroóacfenum r/r/zogenes "tales como NCPPB 8196 o ATCC 15834.

Fig. 1B Dendrograma que demuestra la relación de cepas de Agroóacfer/am como se ha determinado por comparación de ARNr 16S. Las secuencias se compilan usado el programa Clustal W(Saitou 1987). Las cepas se describen por el n° de acceso de GenBank de sus ARNr 16S respectivos. Se evalúan las siguientes cepas:

Especie

N° de acceso

Nombre aiternativo / Nombre en ei dendrograma (si es diferente de) n° de acceso de GenBank)

A fumefac/ens

AB114201

A fumefac/ens

AF388033

Cepa 52

A fumefac/ens

AF388030

Cepa 42

A fumefac/ens

AY306228

NCPPB 4042

A fumefac/ens

AY306224

CSL 3276

A fumefac/ens

AY306223

CSL 3139

A fumefac/ens

AY306222

A fumefac/ens

D14500

A fumefac/ens

AJ389902

NCPPB 1641

A fumefac/ens

AJ012209

C58

A fumefac/ens

S56774

C58

A fumefac/ens

AB102735

A fumefac/ens

AB102734

A fumefac/ens

AB102733

A fumefac/ens

AB102732

A

AY174112

JS71

A

D14506

A

D14504

A r^/zogenes

D14501

A r^/zogenes

X67232

A r^/zogenes

X67224

A y/f/s

D14502

A

D12795

A y/f/s

X67225

R y/f/s

AB118158

R y/f/s

AB114418

A y/f/s

AJ389912

A y/f/s

AJ389911

A

D14503

A

X67228

A

D12787

A /arrymoore/

Z30542

Cepa de Ficus

R/egum/nosarum

D14513

R ga/egae

D11343

(continuación)

Especie

N° de acceso

Nombre aiternativo / Nombre en ei dendrograma (si es diferente dei n* de acceso de GenBank)

S. me/Z/of;

D14509

S. /red/;

D14516

R. /rop/c/

D11344

A. rh/zogenes

K599

BPS 599

A. fume/ac/ens

AGLO

BPS 600

A. fume/ac/ens

AGL1

BPS 601

A. fume/ac/ens

MP90

BPS 602

A. fume/ac/ens

LBA4404

BPS 603

Fig. 1C Dendrograma que demuestra la relación de cepas de /tgroóacfer/trm como se ha determinado por la comparación de secuencias de aminoácidos de virD2. Las secuencias se compilan usando el programa Clustal W 5 (Saitou 1987). Las cepas se describen por el n° de acceso de GenBank de sus proteínas virD2 respectivas. Se evalúan las siguientes cepas:

Especie

N° de acceso

Nombre aiternativo / Nombre en ei dendrograma (si es diferente dei n* de acceso de GenBank)

Agroóac/er/um K599

Ri2659 = K599

A. /umefac/ens

AAL57024

TiAB2/73

A. fume/ac/ens

AD3250

A. fume/ac/ens

B25063

TiA6

A. fume/ac/ens

B37763

TiC58

A. r/i/zogenes

CAA31351

A4b

A. fume/ac/ens

NP 053396

TiSAKURA

A. /ume/ac/ens

NP 059814

Ti15955

A. r/i/zogenes

NP 066749

Ri 1724

A. /ume/ac/ens

NP 396503

TiC58 Cereon

A. /ume/ac/ens

NP 536300

TiC58 UW

Bradyr/i/zob/um japon/cum L/SDA 110

NP 766684

Borde/e//a óronc/i/sepf/ca RB50

NP 887044

A. r/i/zogenes

P13462

RiA4

S/rep/ococcus pneumon/ae TIGR4

ZP 00402780

Borde/e//a óronc/?;'sep/;'ca RB50

ZP 00613251

Azo/oóac/er v/ne/and;7 OP

ZP 00416447

Fig. 2: Mapa de restricción física de la región de ADN-T del plásmido pR¡2659 de Agroóacfer/trm. Las flechas

indican las regiones de límite derecho e izquierdo (de: Combard 1987).

10 Fig. 3 Expresión transitoria de GUS en soja (5 días) de explantes de meristemos axilares de hojas después de 2 días de co-cultivo con tanto AGL1 (pBPSMM192b) (I) como SHA016 (pBPSMM192b) (II). SHA016/pBPSMM192b es

una cepa de variante de K599 de /Sgv-oóacfen'um transgénica desarmada. AGL1/pBPSMM192b es una cepa de control. Las cepas SHA001 y SHA016 de Agroóacfen'um son cepas funcionalmente equivalentes de la cepa K599 de Agroóacfer/um (NCPPB 2659) (pR¡2659Atet), es decir, que comprenden el plásmido pR¡2659Atet desarmado.

Fig. 4 Expresión estable de GUS en soja 35 días después de la infección usando explantes de merlstemos axilares... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para producir una célula de planta transgénica que comprende las etapas de:

a) proporcionar bacterias de una variante de cepa no patógena transgénica de la cepa K599 de /tgroóacfer/u/n (NCPPB 2659) que es una bacteria patógena de las plantas transmitida por la tierra caracterizada por una secuencia ¡ntergénlca de ARNr 16S-23S que comprende al menos un motivo de secuencia seleccionado del grupo que consiste en los motivos de secuencia descritos porSEC ID N°: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14, en el que dicha variante de cepa es capaz de infectar células vegetales, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas y en el que dicha variante de cepa comprende además una variante de plásmido no patógeno del plásmido R¡ pR¡2659 y un ADN-T transgénico, y

b) co-cultlvar una célula de planta con dichas bacterias, y

c) aislar o seleccionar células vegetales que comprenden establemente integrado en su genoma dicho ADN-T transgénico,

en el que dicha variante de cepa no patógena es capaz de infectar células vegetales, para mediar en la transferencia de ADN-T en células vegetales, y para mediar en la inserción de ADN-T en el genoma de la planta, pero carece de propiedades Inductoras del fenotipo de raíces pilosas y

en el que la variante de plásmido no patógeno comprende al menos una secuencia que tiene una identidad de secuencias de al menos el 90 % con una secuencia como se describe por SEC ID N°: 24.

2. Un procedimiento para producir una planta transgénica que comprende las etapas de:

a) proporcionar bacterias de una variante de cepa no patógena, transgénica de la cepa K599 de Agroóacfenum (NCPPB 2659) que es una bacteria patógena de las plantas transmitida por la tierra, caracterizada por una secuencia ¡ntergénlca de ARNr 16S-23S que comprende al menos un motivo de secuencia seleccionado del grupo que consiste en los motivos de secuencia descritos porSEC ID N°: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14, en el que dicha variante de cepa es capaz de infectar células vegetales, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas y en el que dicha vahante de cepa comprende además una variante de plásmido no patógeno del plásmido R¡ pR¡2659 y un ADN-T transgénico, y

b) co-cult¡var una planta, célula de planta o tejido de planta con dichas bacterias, y

c) aislar o seleccionar y, opcionalmente, regenerar plantas que comprenden establemente integrado en su genoma dicho ADN-T transgénico,

en el que dicha variante de cepa no patógena es capaz de infectar células vegetales, para mediar en la transferencia de ADN-T en células vegetales, y para mediar en la inserción de ADN-T en el genoma de la planta, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas y

en el que la variante de plásmido no patógeno comprende al menos una secuencia que tiene una identidad de secuencias de al menos el 90 % con una secuencia como se describe porSEC ID N°: 24.

3. El procedimiento de cualquiera de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha célula de planta, tejido de planta o planta se deriva de una planta seleccionada del grupo de plantas monocotiledóneas, plantas dicotiledóneas y plantas gimnospermas.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha planta es de un género seleccionado del grupo que consiste en Med/cago, Lycopers/co/i, Brass/ca, Cucum/s, So/anam, Jag/ans, Gossyp/um, Ma/us, Mf/s, Anf/rrh/nam, Popa/as, Fragar/a, Araó/dops/s, P/cea, Caps/cam, Chenopod/am, Dendranfdema, Pharó/f/s, Pinas, P/sam, O/yza, Zea, Tr/f/cam, Tn'f/ca/e, Seca/e, Lo/zarn, Pordeam, G/yc/ne, Pseadofsaga, Ka/anchoe, Befa, Pe/ianfhas y Mcof/ana.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho ADN-T transgénico comprende al menos un gen marcador de selección expresable en planta.

6. Una variante de plásmido no patógeno de pR¡2659, proporcionando dicha variante de plásmido las funciones requeridas para la infección y transformación de la célula de planta y que tiene una homología de al menos el 90 % con el ADN que codifica el plásmido pR¡2659 nativo (como está comprendido en la cepa K599 de Agroóacfedum (NCPPB2659)), pero que carece de secuencias que provocan el fenotipo de raíces pilosas, y en la que el ADN-T entero correspondiente a la secuencia descrita por la secuencia de aproximadamente la base 538 a aproximadamente la base 15.519 de SEC ID N°: 4, que incluye los límites, está delecionado y el ADN-T delecionado.

7. Una célula u organismo no humano que comprende una vahante de plásmido no patógeno de la reivindicación 6.

8. La célula u organismo no humano de la reivindicación 7, en el que dicha célula u organismo está seleccionado del grupo que consiste en bacterias, levaduras, plantas, mamíferos e insectos.

9. La célula u organismo no humano de la reivindicación 7 u 8, en el que dicha célula u organismo es una bacteria transmitida por la tierra del género Ph/zoó/aceae.

10. Una variante de cepa no patógena de la cepa K599 de Agrobacfenum (NCPPB 2659), que es una bacteria patógena de las plantas transmitida por la tierra, caracterizada por una secuencia intergénica de ARNr 16S-23S que comprende al menos un motivo de secuencia seleccionado del grupo que consiste en los motivos de secuencia descritos por SEC ID N°: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14, en la que dicha variante de cepa es capaz de infectar

5 células vegetales, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas, que comprende una variante de plásmido no patógeno del plásmido R¡ pR¡2659, que comprende al menos una secuencia que tiene una identidad de secuencias de al menos el 90 % con una secuencia como se describe por SEC ID N°: 24.

11. Una variante de cepa no patógena transgénica de la cepa K599 de Agrobacfe/ftvm (NCPPB 2659), que es una bacteria patógena de las plantas transmitida por la tierra, caracterizada por una secuencia intergénica de ARNr 16S-

10 23S que comprende al menos un motivo de secuencia seleccionado del grupo que consiste en los motivos de

secuencia descritos por SEC ID N°: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14, en la que dicha variante de cepa es capaz de Infectar células vegetales, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas, y en la que dicha vahante de cepa comprende además una variante de plásmido no patógeno del plásmido R¡ pR¡2659 que comprende al menos una secuencia que tiene una identidad de secuencias de al menos el 90 % con una secuencia

15 como se describe por SEC ID N°: 24 y que comprende un ADN-T transgénico.

12. La variante de cepa no patógena de cualquiera de la reivindicación 10 u 11, en la que dicha variante de cepa no patógena es capaz de infectar células vegetales, para mediar en la transferencia de ADN-T en células vegetales, y para mediar en la inserción de ADN-T en el genoma de la planta, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas.

20 13. La variante de cepa no patógena de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en la que la variante de plásmido

no patógeno se define como en la reivindicación 6.

14. La vahante de cepa no patógena de cualquiera de las reivindicaciones 10 o 13, que comprende además una o más características seleccionadas del grupo que consiste en la presencia de genes v/rA o v/rG mutantes o quiméricos o la presencia de plásmidos super-virulentos.