Células madre hematopoyéticas tratadas mediante fucosilación in vitro y métodos de uso.

Un método para mejorar el enlace con selectina P o selectina E de células madre hematopoyéticas

(CMHs) de médula ósea o sangre periférica que tienen un enlace disminuido con selectina P o selectina E, que comprende:

tratar una cantidad de CMHs de médula ósea o CMHs de sangre periférica, teniendo al menos una parte de ellas un enlace disminuido con selectina P o selectina E y caracterizadas porque el ligando-1 de glicoproteína de selectina P (PSGL-1) que carece de una α1,3-fucosa, in vitro con una α1,3-fucosiltransferasa y un donante de fucosa que forman CMHs fucosiladas, donde las CMHs fucosiladas han mejorado el enlace con selectina P o selectina E.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10181456.

Solicitante: OKLAHOMA MEDICAL RESEARCH FOUNDATION.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 825 N.E. 13TH STREET OKLAHOMA CITY, OK 73104 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: MCEVER, RODGER, P., XIA,LIJUN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen sustancias... > A61K35/12 (Sustancias procedentes de mamíferos; Composiciones que comprenden tejidos o células indeterminadas; Composiciones que comprenden células madre no embrionarias; Células modificadas genéticamente (células madre no caracterizadas A61K 35/545; vacunas o preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > C12N5/00 (Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/0789 (Células madre; Células progenitoras multipotentes)

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Fragmento de la descripción:

DESCRIPCIÓN

Células madre hematopoyéticas tratadas mediante fucosilación in vitro y métodos de uso.

Referencia Cruzada a Solicitudes Relacionadas 5

Esta solicitud reivindica el beneficio en virtud de la 35 U.S.C. 119 (e) de la Solicitud Provisional Nº de Serie 60/463.788, presentada el 18 de Abril del 2003.

Declaración sobre Investrigación o Desarrollo Patrocinado Federalmente 10

Algunos aspectos de esta invención se hicieron en el transcurso de la Concesión 5P5OHL54502 otorgada por el Instituto Nacional de la Salud y por lo tanto el Gobierno tiene ciertos derechos en algunos aspectos de esta invención.

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Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere generalmente a métodos para tratar células madre hematopoyéticas (CMHs) para mejorar su utilidad terapéutica y más particularmente, pero no limitado a, tratar células madre hematopoyéticas derivadas de sangre del cordón, y células madre hematopoyéticas así tratadas. 20

Durante la inflamación, la selectina P y la selectina E median cooperativamente la circulación y adhesión de leucocitos sobre superficies vasculares (McEver, R.P. Selectinas: lectinas que inician la adhesión celular bajo flujo. Curr Opin Cell Biol. 2002 Oct; 14:581-856) . En el proceso de trasplante de médula ósea, la selectina P y la selectina E también median la conducción de CMHs inyectadas intravenosamente a la médula ósea. (Frenette, P.S., 25 Subbarao, S., Mazo, I.B., Von Andrian, U.H., Wagner, D.D. Selectinas endoteliales y molécula-1 de adhesión celular vascular promueven la conducción del progenitor hematopoyético a la médula ósea. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998; 95:14423-14428) . En la mayoría de los tejidos, la selectina P y la selectina E se expresan en células endoteliales después de la estimulación de agonistas, pero se expresan constitutivamente en células endoteliales de la médula ósea. Las selectinas usan glicanos α2, 3-sialilados y α1, 3-fucosilados tales como sialil LewisX (sLex) en 30 glicoproteínas o glicolípidos como ligandos. La selectina P se enlaza a la región de terminal N del ligando-1 de glicoproteína de selectina P (PSGL-1) , que contiene sulfatos de tirosina y un glicano O tapado con sLeX. La selectina E se enlaza con uno o más sitios diferentes en PSGL-1. Para interactuar con la selectina E, PSGL-1 no necesita la sulfación de tirosina, pero la expresión de sLeX sobre glicanos O mejora el enlace. La selectina E también interactúa con otros ligandos sobre CMHs. Una isoforma de CD44 sobre CMHs ha demostrado que se enlaza con la selectina 35 E in vitro (Dimitroff, C. J. Lee, J. Y:, Rafii, S., Fuhlbrigge, R. C., Sackstein, R. CD44 es un ligando principal de selectina E en células madre hematopoyéticas de progenitor. J. Cell Biol. Jun 11 2001; 153:1277-1286) . Otro ligando potencial para la selectina E sobre CMHs es el ligando-1 de selectina E (ESL-1) (Wild, M. K., Huang, M. C., Schulze-Horsel, U. van Der Merwe, P.A., Vestweber, D. Afinidad, cinética y termodinámica de enlace de selectina E que se enlaza con ligando-1 de selectina E. J Biol Chem. 2001 Ago 24; 276:31602-31612) . Se piensa que cada uno de 40 estos ligandos transporta estructuras sLeX.

Las células madre hematopoyéticas cosechadas de un individuo pueden trasplantase a la médula ósea de otro individuo siguiendo una infusión intravenosa. La técnica se ha usado en gran medida en el tratamiento de varios desordenes hematológicos tales como leucemia (Thomas, E. D, Historia, resultados actuales e investigación en 45 trasplantes de médula ósea. Perspectives Biol. Med. 38:230-237, 1995) . Clínicamente, las CMHs humanas se obtienen de tres fuentes diferentes: médula ósea, sangre periférica adulta después de la movilización, y sangre del cordón obtenida de cordones umbilicales después del parto. Aunque hay más de 5 millones de donantes voluntarios de médula ósea no relacionados registrados en todo el mundo, encontrar un donante no relacionado que coincida completamente con el antígeno leucocitario humano (ALH) sigue siendo un problema para muchos pacientes debido 50 al polimorfismo de ALH. En comparación con la médula ósea y la sangre periférica humana, la sangre del cordón tiene varias ventajas potenciales, en particular la amplia y rápida disponibilidad de células y menos requisitos rigurosos para la identidad de ALH entre donante y receptor debido al bajo riesgo de enfermedad de injerto contra huésped (EICH) severa y crónica (Rocha, V., et al., Comparación de resultados de trasplantes no relacionados de médula ósea y sangre del cordón umbilical en niños con leucemia aguda. Blood. 97:2962-71. 2002) . Las ventajas 55 potenciales del trasplante usando CMHs de la sangre del cordón en lugar de CMHs de la médula ósea o sangre periférica adulta incluyen: (1) un gran grupo de donantes potenciales; (2) rápida disponibilidad, ya que la sangre del cordón se ha pre-cribado y testado; (3) puede conseguirse mayor diversidad racial en los bancos al concentrar los esfuerzos de recogida en hospitales donde nacen niños bajo orígenes étnicos representados; (4) riesgo reducido de incomodidad para el donante; (5) rara contaminación por virus; y (6) menor riesgo de enfermedad de injerto contra 60 huésped (donde las células del donante atacan los órganos y tejidos del paciente) , incluso para receptores con una coincidencia de tejido menos que perfecta. De este modo, las CMHs derivadas de la sangre del cordón se han usado cada vez más para trasplante de médula ósea en años recientes.

En el escenario del trasplante, las CMHs infusionadas intravenosamente se extravasan específicamente en 65 la médula ósea para implantar y proliferar, un proceso que se define como conducción CMH. La conducción se ha estudiado extensamente tanto in vivo como in vitro y se cree que se basa en las interacciones de la molécula de adhesión entre CMHs y el endotelio de la médula ósea. Las selectinas con un grupo de moléculas de adhesión que contienen un dominio de reconocimiento de carbohidrato en terminal N relacionado con aquellos en las lectinas animales Ca++-dependientes (tipo C) . La selectina P, expresada en plaquetas activadas y células endoteliales, y la selectina E, expresada en células endoteliales activadas, se enlazan con ligandos glicoconjugados en leucocitos y 5 CMHs. El ligando de glicoproteína mejor caracterizado es PSGL-1, una mucina con muchos oligosacáridos enlazados con O sialilados y fucosilados. PSGL-1 se expresa en leucocitos y CMHs. Los estudios con ratones deficientes de PSGL-1 han demostrado que PSGL-1 media la atadura de leucocitos y la conducción sobre selectina P y apoya la unión de selectina E en flujo. PSGL-1 también se enlaza con la selectina L, que inicia las interacciones leucocito-leucocito que amplifican la conducción de leucocitos sobre superficies de células endoteliales inflamadas. 10 En PSGL-1 humano, el sitio de enlace de la selectina P y la selectina L comprende una secuencia peptídica que contienen tres residuos de sulfato de tirosina cercanos a una trionina a la que se une un específico glicano-O núcleo-2 fucosilado ramificado (McEver, R. P., Cummings, R. D. Papel de enlace de PSGL-1 con selectinas en reclutamiento de leucocitos. J Clin Inves. 100:S97-103. 1997; R. P. McEver: Selectinas: Ligandos que inician la adhesión celular bajo flujo. Curr. Op. In Cell Biol. 14: 581-586, 2002) . La fracción de fucosa es esencial para el 15 enlace de selectina P como se mide por ensayos in vitro que usan glicosulfopéptidos sintéticos. La fucosilación se cataliza por una familia de α1, 3-fucosiltransferasas. Entre ellas, α1, 3-fucosiltransferasa IV (FT-IV) y α1, 3-fucosiltransferasa VII (FT-VII) se expresan principalmente en leucocitos humanos. Estas enzimas catalizan la transferencia de un residuo de... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para mejorar el enlace con selectina P o selectina E de células madre hematopoyéticas (CMHs) de médula ósea o sangre periférica que tienen un enlace disminuido con selectina P o selectina E, que comprende:

5

tratar una cantidad de CMHs de médula ósea o CMHs de sangre periférica, teniendo al menos una parte de ellas un enlace disminuido con selectina P o selectina E y caracterizadas porque el ligando-1 de glicoproteína de selectina P (PSGL-1) que carece de una α1, 3-fucosa, in vitro con una α1, 3-fucosiltransferasa y un donante de fucosa que forman CMHs fucosiladas, donde las CMHs fucosiladas han mejorado el enlace con selectina P o selectina E. 10

2. El método de la reivindicación 1 donde al menos una parte de la cantidad de CMHs carecen de o tienen una expresión reducida de proteína de superficie CD38 y/o tienen habilidad de conducción de la médula ósea reducida..

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde una parte de la cantidad de CMHs expresa PSGL-1 que tiene glicanos 15 no fucosilados u O-glicanos no fucosilados.

4. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde una parte de la cantidad de CMHs expresa PSGL-1 que tiene O-glicanos núcleo-2 que comprenden NeuAcα2, 3Galβ1, 4GlcNac y que carecen de una fucosa en la unión α1, 3 con el GlcNAc o que comprenden otros glicanos que carecen de fucosilación apropiada. 20

5. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde al menos el 50% de las CMHs fucosiladas tratadas tienen fluorescencia de enlace con selectina P que excede un umbral de fluorescencia predeterminado en un ensayo de selectina P o que tienen fluorescencia de enlace con selectina E que excede un umbral de fluorescencia predeterminado en un ensayo de selectina E. 25

6. El método de la reivindicación 1 ó 2, en donde la α1, 3 fucosiltransferasa es una α1, 3 fucosiltransferasa IV, una α1, 3 fucosiltransferasa VI, o una α1, 3 fucosiltransferasa VII, y está libre o está unida a un soporte.

7. El método de la reivindicación 1 ó 2 en donde le donante de fucosa es GDP-fucosa 30

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde al menos el 10%, 25%, 50%, 75%, 90% o 95% de las CMHs fucosiladas enlaza con la selectina P o la selectina E.

9. Una composición de CMHs de médula ósea o sangre periférica, que comprende: 35

CMHs CD34+ de médula ósea o CMHs CD34+ de sangre periférica que carecen de o tienen una expresión reducida de proteína de superficie CD38; donde las CMHs de médula ósea o CMHs de sangre periférica se han fucosilado in vitro de tal manera que al menos el 90% de las CMHs CD34+ de médula ósea o CMHs CD34+ de sangre periférica se enlazan con selectina E o selectina P; y 40

un transportador, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. La composición de la reivindicación 9 donde al menos el 95% del las CMHs CD34+ de médula ósea o CMHs CD34+ de sangre periférica se enlaza con selectina P o selectina E.

45

11. CMHs de médula ósea o CMHs de sangre periférica de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10 para su uso en el tratamiento de una enfermedad hematológica en un sujeto, o para su uso en reconstituir completamente la médula ósea en un sujeto irradiado y/o un individuo sometido a quimioterapia, o para su uso en tratar médula ósea que haya destruida por terapia ablativa, en un paciente. 50

12. Las CMHs de médula ósea o CMHs de sangre periférica de la reivindicación 11 para su uso de aceurdo a la reivindicación 11 donde la enfermedad hematológica es una de leucemia linfocítica aguda, leucemia mielógena aguda, mielodisplasia, leucemia mielógena crónica, leucemia mielógena crónica juvenil, o anemia de células falciformes. 55

13. Un producto de sangre que contiene CMHs de médula ósea o CMHs de sangre periférica que comprende:

una población de CMHs de médula ósea humana o CMHs de sangre periférica fucosiladas que comprenden células caracterizadas como CD34+CD38baja/-, donde las CMHs de médula ósea o CMHs de sangre periférica 60 se han fucosilado in vitro de tal manera que al menos el 90% de las CMHs CD34+CD38baja/- se enlazan con selectina P o selectina E y están dispuestas en un transportador, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. El producto de sangre de la reivindicación 13 que además comprende una fucosiltransferasa libre o una 65 fucosiltransferasa unida a un soporte.

15. El producto de sangre de cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14 donde al menos el 95% de las CMHs CD34+CD38baja/- se enlaza con selectina P o selectina E.