Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España en los últimos 80 años. Clasificación Internacional de Patentes CIP 2013.

BIOMARCADOR DE CÉLULAS CARTILAGINOSAS HUMANAS.

Patente de Invención. Resumen:

Biomarcador de células cartilaginosas humanas.

La presente invención se refiere al uso de un biomarcador en la selección de células destinadas al trasplante

, en concreto, un biomarcador de células precursoras del cartílago que comprende al menos un producto de expresión del gen susd-2 y sus derivados.

Solicitante: SERVICIO ANDALUZ DE SALUD.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: ALAMINOS MINGORANCE,MIGUEL, CAMPOS MUÑOZ,Antonio, HERNANDEZ CORTES,Pedro, MORALES VILLAESCUSA,Alvaro.

Fecha de Publicación de la Concesión: 31 de Octubre de 2012.

Clasificación Internacional de Patentes: A61K35/32 (..Huesos; Tendones; Dientes; Cartílago (médula 35/28) [2]), C12N5/077.

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BIOMARCADOR DE CÉLULAS CARTILAGINOSAS HUMANAS.
Descripción:

Biomarcador de células cartilaginosas humanas.

Campo de la técnica

La presente invención se encuadra en el campo de la biomedicina y, más específicamente, de la ingeniería tisular y medicina regenerativa. En concreto, la presente invención se refiere al uso de un biomarcador en la selección de células destinadas al trasplante.

Estado de la técnica anterior

El cartílago es un tejido conectivo especializado, el cual posee una matriz flexible firme que resiste a las tensiones mecánicas. Participa en el sostén del cuerpo, por estar íntimamente asociado al sistema esquelético. El cartílago posee células llamadas condrocitos, que ocupan cavidades pequeñas llamadas lagunas dentro de la matriz extracelular que secretan. La matriz extracelular del cartílago no está vascularizada ni inervada, y no posee vasos linfáticos; sin embargo, las células reciben su nutrición a partir de los vasos sanguíneos de los tejidos conectivos circundantes y del líquido sinovial por difusión a través de la matriz. La matriz extracelular está compuesta por glucosaminoglucanos y proteoglucanos, íntimamente asociados con fibras de colágeno y elásticas embebidas en la matriz (Deiters y Prehm, Arthritis Res Ther. 2008; 10(1):R8).

Según las fibras que se encuentren en la matriz extracelular, existen tres tipos de cartílago (Finn y Geneser, 3ª ed., 2000):

Cartílago Hialino: La matriz extracelular es flexible y semitranslúcida, de color gris azuloso, rica en colágeno tipo II. Es el más frecuente del cuerpo. Se encuentra en nariz, laringe, extremos ventrales de las costillas (en los sitios en los que éstas conectan con el esternón), y en los anillos traqueales y bronquiales. Este cartílago forma el modelo cartilaginoso de muchos de los huesos durante el desarrollo embrionario, y constituye las placas epifisiarias de los huesos en crecimiento.

Cartílago Elástico: El cartílago elástico se encuentra en orejas, conductos auditivos externo e interno, epiglotis y laringe (cartílago cuneiforme). En casi todos los aspectos, el cartílago elástico es idéntico al cartílago hialino, y frecuentemente se relaciona con él. La capa fibrosa externa de pericondrio (tejido conectivo denso irregular, encargado del crecimiento y la regeneración del cartílago) es rica en fibras elásticas. La matriz del cartílago elástico posee abundantes fibras elásticas ramificadas que varían entre finas y gruesas, interpuestas con haces de fibras colágenos de tipo II, aportando mayor flexibilidad que la matriz del cartílago hialino. Los condrocitos del cartílago elástico son más abundantes y de mayor tamaño que los del cartílago hialino.

Fibrocartílago: Se encuentra en discos intervertebrales, sínfisis del pubis y discos articulares, e insertado en el hueso. Se encuentra asociado con cartílago hialino y con tejido conectivo denso. A diferencia de los otros dos tipos de cartílago, el fibrocartílago no posee pericondrio, tiene una cantidad escasa de matriz extracelular rica en condroitín sulfato y dermatán sulfato y presenta haces de colágeno tipo II. Los condrocitos suelen encontrase alineados en filas paralelas alternativas con los haces gruesos de colágeno.

Numerosas patologías pueden afectar al cartílago humano, siendo muy frecuentes las enfermedades de origen autoinmune, infeccioso, traumático o degenerativo, destacando por su elevada frecuencia la artrosis, la artritis y las úlceras de la superficie articular. Todas estas enfermedades presentan una altísima incidencia y suponen un gran gasto sanitario en nuestro medio.

Los tratamientos convencionales para la reparación del cartílago articular incluyen microfracturas, mosaicoplastias, y el uso de autoinjertos y trasplantes heterólogos. El trasplante autólogo de condrocitos ha surgido como una alternativa al tratamiento clínico convencional de los defectos cartilaginosos, siendo posible en muchos casos reducir el dolor y mejorar la función articular del paciente mediante el implante autólogo de condrocitos. Hasta el momento, la investigación en este campo se basa en el cultivo de condrocitos para su aplicación clínica como células en suspensión (ACI, autologous chondrocyte implant) o, más recientemente, para su cultivo sobre membranas biocompatibles, aplicándose al paciente como una membrana sobre la cual se cultiva una monocapa de células cartilaginosas (MACI, membrane autologous chondrocyte implant). Sin embargo no existe un tejido artificial óptimo para el crecimiento de dichos condrocitos.

Desde 1987, múltiples investigadores han desarrollado protocolos de cultivo e implante clínico de condrocitos cultivados en laboratorio en más de 12.000 pacientes (Marlovits et al., Eur J Radiol. 2006, 57(1):24-31), siendo los resultados muy variables de un estudio a otro. Mientras algunos ensayos sugieren que el uso de estas técnicas puede resolver los problemas articulares de forma muy efectiva, la mayoría de los estudios, incluyendo metaanálisis y trabajos de revisión, demuestran que la utilidad del implante autólogo de condrocitos es muy limitada. Probablemente, esto se deba a la baja densidad del tejido cartilaginoso formado o la insuficiente cantidad y calidad de las células implantadas en el paciente. En general, el cartílago generado tras el implante autólogo de condrocitos es rico en colágeno tipo I, con características bioquímicas y biomecánicas deficientes y muy distintas de las existentes en el cartílago nativo, rico en colágeno tipo II (Tuli et al., Arthritis Res Ther. 2003, 5(5):235-238). Este hecho podría deberse, con elevada probabilidad, a que las células utilizadas para la terapia celular del cartílago podrían presentar bajos índices de viabilidad celular o bien por el uso de células diferentes a condrocitos bien diferenciados y funcionales.

Numerosos investigadores han demostrado que las células adultas humanas tienden a desdiferenciarse y a perder funcionalidad cuando se mantienen en cultivo durante tiempos prolongados (Rodríguez-Morata et al., Ann Vasc Surg. 2008, 22(3):440-448; Alaminos et al., J Cell Physiol. 2007, 211(3):692-698). Del mismo modo, es muy frecuente encontrar células mesenquimales o conectivas contaminantes de los cultivos de condrocitos, especialmente los fibroblastos procedentes del pericondrio. Por ese motivo, es importante desarrollar métodos que permitan controlar los niveles de diferenciación de las células cultivadas para asegurar el uso de células bien diferenciadas en la terapia celular del cartílago y evitar el uso de células contaminantes. A pesar de ello, hasta la fecha no se han descrito marcadores suficientemente específicos de los condrocitos humanos, utilizándose hasta el momento criterios puramente morfológicos junto con la expresión de colágeno II o agrecán, compuestos existentes en la matriz extracelular del cartílago hialino maduro.

El gen sushi domain containing protein-2 (susd-2; número de acceso genbank AK026431), está conservado en mamíferos (chimpancé, perro, vaca, ratón, rata) aves (pollo) peces (pez cebra) e invertebrados (mosca de la fruta, mosquito y C. elegans). En humanos, el gen susd-2 está localizado en el cromosoma 22q11-q12. La expresión de SUSD2 no ha sido determinada hasta la fecha en células del cartílago humano o animal. La predicción de los niveles de expresión se puede llevar a cabo utilizando programas informáticos como e-Northern (Northern-Blot virtual), el cual indica que los niveles de ARNm podrían ser elevados en riñón y pulmón, pero no en cartílago (Gene-Cards, http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=SUSD2&search=SUSD2).

Para asegurar el éxito de la terapia celular con condrocitos autólogos, sería necesario contar con un marcador específico del condrocito humano que se exprese en la superficie o en el citoplasma de las células mantenidas en cultivo. Además, el campo de la técnica carece de una plataforma biocompatible que provea las condiciones óptimas para la regeneración del tejido cartilaginoso.

Explicación de la invención

La presente invención provee un nuevo biomarcador de condrocitos en cultivo que permite la identificación específica de las células de linaje cartilaginoso frente a otras células de estirpe mesenquimal o conectiva presentes en el cultivo. El uso del biomarcador de la presente invención junto con una plataforma de crecimiento específica para condrocitos optimiza la regeneración del tejido cartilaginoso.

Los inventores de la presente solicitud han descubierto que, sorprendentemente, el gen susd-2 se expresa en condrocitos humanos mantenidos en cultivo y por lo tanto se puede utilizar para diferenciar éstos de otros tipos de células mesenquimales y conectivas también presentes.

Así, un primer objeto de la presente invención es un biomarcador de células precursoras del cartílago caracterizado porque comprende al menos un producto de expresión del gen susd-2 o algún fragmento de al menos uno de ellos.

La presente invención facilita la selección de los condrocitos en cultivo mediante el análisis de los niveles de expresión del gen susd-2. Los productos de expresión de dicho gen pueden ser su ARN mensajero (ARNm; de ahora en adelante también SEQ ID No 1) o la proteína que codifica, denominada sushi domain containing 2 (SUSD2; de ahora en adelante también SEQ ID No 2). Según esto, en una realización preferida, el biomarcador de la presente invención comprende la SEQ ID No 1 o algún fragmento de esta. Así mismo, en otra realización preferida, el biomarcador de la presente invención comprende la SEQ ID No 2 o algún fragmento de esta.

Para determinar la expresión del biomarcador de la presente invención, se utilizan técnicas ampliamente conocidas en el campo de la técnica. Por ejemplo, la expresión del gen susd-2 en su forma de SEQ ID No1 se puede analizar mediante RT-PCR cuantitativa o microarrays de ARN. Mientras que para analizar la expresión en su forma de SEQ ID No 2 se utilizan técnicas de inmunohistoquímica, western-blot o microarrays de proteínas.

Tal como se ha mencionado anteriormente, la utilidad del biomarcador de la presente invención viene definida por proveer capacidad discriminatoria a la hora de seleccionar las células de un cultivo que realmente van a dar lugar a condrocitos maduros y funcionales una vez transplantados. Por esto, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del biomarcador de la presente invención en la selección de células in vitro destinadas al trasplante. En una realización preferida, el biomarcador de la presente invención se utiliza en la selección de células in vitro para la preparación de un implante celular. En otra realización preferida, el biomarcador de la presente invención se utiliza en la selección de células in vitro para la preparación de un tejido artificial.

Más preferentemente, el biomarcador de la presente invención se utiliza en un método de preparación in vitro de un tejido artificial que comprende un paso de selección in vitro de células en cultivo que expresan el gen susd-2.

Descripción de las figuras

Figura 1. Cuantificación del ARNm del gen susd-2 en diferentes tipos de cartílago así como en distintos tipos celulares. Los valores obtenidos se expresan en unidades de fluorescencia. Estos datos demuestran que la expresión del gen susd-2 es significativamente mayor en todos los tipos de cartílago en comparación con células procedentes de tejido epitelial y células mesenquimales.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

Ejemplo 1

Cuantificación de los niveles de expresión del gen susd-2 en condrocitos en cultivo

El análisis se ha realizado cuantificando la expresión de susd-2 a nivel de ARNm utilizando microarrays comerciales de ARN de la casa comercial Affymetrix® (sistema Human-Genome U133 plus 2.0). Los resultados muestran que la expresión media de este gen en el cartílago humano es de 957,9 U.F. (unidades fluorescentes de la casa comercial Affymetrix®), siendo 1612,7 U.F. en el cartílago hialino humano y 303,1 U.F. en el cartílago fibroso (fibrocartílago). Estos valores son significativamente superiores (p<0.001) a los encontrados en otros tipos de células mesenquimales, incluyendo los fibroblastos de la mucosa oral y de la piel y las células madre mesenquimales de la gelatina de Wharton del cordón umbilical (media 85,6 U.F.) y en células epiteliales de la córnea y de la mucosa oral (media 29,6 U.F.) (Figura 1 y Tabla 1).

Estos resultados demuestran que los condrocitos mantenidos en cultivo expresan cantidades significativamente superiores de ARNm del gen susd-2 a que otros tipos celulares tanto de tipo mesenquimal como de tipo epitelial, por lo que su cuantificación podría ser un útil biomarcador específico de condrocitos humanos para uso clínico.





Reivindicaciones:

1. Biomarcador de células precursoras del cartílago caracterizado porque comprende al menos un producto de expresión del gen susd-2.

2. Biomarcador según la reivindicación 1 caracterizado porque comprende la SEQ ID No 1.

3. Biomarcador según la reivindicación 1 caracterizado porque comprende la SEQ ID No 2.

4. Uso de un biomarcador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la selección de células in vitro destinadas al transplante.

5. Uso según la reivindicación 4 en la selección de células in vitro para la preparación de un implante celular.

6. Uso según la reivindicación 4 en la selección de células in vitro para la preparación de un tejido artificial.


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