Un anticuerpo que se une específicamente a CD22, anticuerpo que comprende:

una cadena ligera variable (VL) que tiene la secuencia según se define en SEC ID N.º 2 y una cadena pesada variable (VH) que tiene la secuencia según se define en SEC ID N.º 4, con la condición de que:

(i) la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 30 y 31 de la cadena VL se seleccionan entre HG, GR, RG y AR; y

(ii) la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 104, 105 y 106 de la cadena VH se seleccionan entre SSY, THW, YNW, TTW y STY

Anticuerpos anti-CD22 e inmunoconjugados mutados.

Antecedentes de la invención

Los tumores malignos hematológicos son un problema de salud pública muy importante. Se ha estimado que, en el año 2000, se produjeron más de 50.000 nuevos casos de linfoma de no Hodgkin y más de 30.000 nuevos casos de leucemia en Estados Unidos (Greenlee, R. T. et al., CA Cancer J Clin., 50: 7-33 (2000)), enfermedades de las cuales se esperaban más de 45.000 muertes. Hay muchos más pacientes que viven con una morbosidad relacionada con enfermedades crónicas. Desafortunadamente, en un alto porcentaje de los pacientes, las terapias convencionales no pueden producir remisiones completas a largo plazo.

En los últimos años, se han desarrollado inmunotoxinas como enfoque terapéutico alternativo para tratar estos tumores malignos. Originariamente, las inmunotoxinas estaban compuestas por un anticuerpo conjugado químicamente con una toxina vegetal o bacteriana. El anticuerpo se une al antígeno expresado en la célula diana y la toxina es interiorizada provocando la muerte celular mediante la detención de la síntesis proteica y la inducción de la apoptosis (Brinkmann, U., Mol. Med. Today, 2: 439- 446 (1996)).

Los tumores malignos hematológicos constituyen una interesante diana para las terapias con inmunotoxinas, porque las células tumorales son fácilmente accesibles y los antígenos diana se expresan a un nivel elevado (Kreitman, R. J. y Pastan, I., Semin. Cancer Biol., 6: 297-306 (1995)). Uno de estos antígenos es el CD25. Una prueba clínica con la inmunotoxina LMB-2 (anti-Tac(Fv)-PE38) dirigida a CD25 demostró que el agente fue bien tolerado y que tenía una considerable actividad antitumoral (Kreitman, R. J. et al., Blood, 94: 3340-3348 (1999); Kreitman, R. J. et al., J. Clin. Oncol., 18: 16222-1636 (2000)). Se observó una respuesta completa en un paciente con leucemia de células vellosas y respuestas parciales en pacientes con leucemia de células vellosas, leucemia linfocítica crónica, linfoma de células T cutáneas, enfermedad de Hodgkins y leucemia de células T del adulto.

Otro antígeno que ha sido usado como una diana de inmunotoxina es el CD22, un antígeno de células B restringido a un linaje expresado en el 60-70% de los linfomas y las leucemias de células B. El CD22 no está presente en la superficie celular en los estadios tempranos del desarrollo de las células B y no se expresa en células madre (Tedder, T. F. et al., Annu. Rev. Immunol., 5:481-504 (1997)). Se han realizado pruebas clínicas con una inmunotoxina que contiene un anticuerpo frente a CD22, el RFB4, o su fragmento Fab, acoplado a ricina A desglicosilada. En estas pruebas, se han observado respuestas clínicas sustanciosas; sin embargo, el grave y, en ciertos casos, fatal síndrome de fuga vascular fue limitante de la dosis (Sausville, E. A. et al., Blood, 85: 3457-3465 (1995); Amlot, P. L. et al., Blood, 82: 2624-2633 (1993); Vitetta, E. S. et al., Cancer Res., 51: 4052-4058 (1991)).

Como enfoque alternativo, se usó el anticuerpo RFB4 para crear una inmunotoxina recombinante en la que el fragmento Fv en una forma monocatenaria está fusionado a una forma truncada de 38 kDa de la exotoxina A de Pseudomonas (PE38). La PE38 contiene los dominios de translocación y de ribosilación del ADP de PE, pero carece de la parte de unión celular (Hwang, J. et al., Cell, 48: 129-136 (1987)). La RFB4(Fv)-PE38 es citotóxica frente a las células positivas en CD22 (Mansfield, E. et al., Biochem. Soc. Trans., 25:709-714 (1997)). Para estabilizar la inmunotoxina de Fv monocatenario y hacerla más adecuada para el desarrollo clínico, se diseñaron genéticamente residuos de cisteína en regiones marco de la V_H y la V_L (Mansfield, E. et al., Blood, 90: 2020-2026 (1997)) generando la molécula RFB4(dsFv)-PE38.

RFB4(dsFv)-PE38 puede matar células leucémicas de pacientes y produjo remisiones completas en ratones que portaban xenoinjertos de linfoma (Kreitman, R. J. et al., Clin. Cancer Res., 6: 1476-1487 (2000); Kreitman, R. J. et al., Irat. J. Cancer, 81: 148-155 (1999)). La RFB4(dsFv)-PE38 (BL22) fue evaluada en una prueba clínica de fase I en el Instituto Nacional del Cáncer en pacientes con tumores malignos hematológicos. Se trataron dieciséis pacientes con leucemia de células vellosas resistente a análogos de purina con BL22 y once de ellos (86%) alcanzaron remisiones completas.

Estos resultados muestran que BL22 es el primer agente capaz de producir una tasa elevada de remisión completa en pacientes con LCV resistente a análogos de purina y de establecer el concepto de que las inmunotoxinas pueden producir un beneficio clínico en pacientes con tumores malignos avanzados (Kreitman, R. J., et al., N. Engl J. Med., 345 (4): 241-7 (2001)).

HA22 es una forma mejorada, desarrollada recientemente, de BL22. Para producir esta inmunotoxina, se mutó la región de unión del anticuerpo RFB4 y se usó un despliegue en fagos del anticuerpo para aislar el fago mutante que mejor se uniera a CD22 debido a las mutaciones en CDR3 de la cadena pesada. En HA22, los residuos SSY de CDR3 de la cadena pesada de la región variable del anticuerpo ("V_H") se mutaron a THW. En comparación con su anticuerpo parental RFB4, HA22 tiene una actividad citotóxica de 5-10 veces mayor en diversas líneas celulares positivas en CD22 y es hasta 50 veces más citotóxico para las células de pacientes con LLC y LCV (Salvatore, G., et al., Clin Cancer Res, 8(4):995-1002 (2002); véase también la solicitud en co-propiedad PCT/US02/30316, Publicación internacional WO 03/027135).

BL22 parece funcionar bien en tumores malignos, tales como la LCV, que expresan cantidades relevantes de CD22. Sin embargo, mostró una actividad mucho menor en la leucemia linfocítica crónica (LLC), en la que las células sólo expresan cantidades pequeñas de CD22. Como se indica anteriormente, la inmunotoxina basada en HA22 es mucho más citotóxica para las células de personas con LLC que BL22. Sin embargo, dada la baja densidad de CD22 en las células de la LLC, sería deseable seguir mejorando la dirección hacia las células de la LLC mediante el desarrollo de anticuerpos con una afinidad incluso mayor por CD22 que la de HA22.

Desafortunadamente, los factores que influyen en la afinidad de unión son muy diversos, y la obtención de fragmentos Fv monocatenarios con una mayor afinidad no es algo trivial. Aunque la estructura cristalina de anticuerpo-antígeno puede sugerir qué residuos están implicados en la unión, no se disponen de los datos estructurales de resolución atómica de la mayoría de los anticuerpos. Además, incluso cuando se dispone de tales datos, en general, no se puede predecir qué residuos y qué mutaciones darán como resultado un anticuerpo con una mayor actividad de unión antigénica.

Sin embargo, incluso si las inmunotoxinas se unen estrechamente a la superficie de células diana, no se garantiza la muerte de la célula diana. Las toxinas comúnmente usadas (p. ej., la toxina de la difteria, gelonina, ricino y PE) actúan a nivel ribosómico para desactivar la síntesis proteica. De este modo, la toxina debe ser dirigida correctamente al ribosoma para que tenga lugar la muerte celular. La dirección de inmunotoxinas a receptores de la superficie celular específicos implica una endocitosis mediada por el receptor en una vesícula intracelular apropiada, seguida por la translocación de la toxina a través de la membrana vesicular hacia el citosol. Un tráfico intracelular ineficiente, p. ej., el transporte de las inmunotoxinas hacia los lisosomas, da como resultado una gran reducción de la utilización de la toxina diana (Thrush, G. R., et al., Annu Rev Immunol, 14:49-71 (1996)).

De este modo, además de aumentar la afinidad de anticuerpos tales como BL22 o HA22 frente a CD22, otro modo de aumentar la citotoxicidad de las inmunotoxinas hacia las células de la LLC consistiría en aumentar la citotoxicidad del resto de toxina. Como se indica anteriormente, una prueba clínica de BL22 usó como la forma tóxica una forma de la exotoxina A de Pseudomonas ("PE") truncada para reducir la toxicidad inespecífica, y la PE se ha usado en pruebas clínicas con otros agentes de dirección a dianas. Dada la utilidad de la PE en agentes terapéuticos, sería útil seguir mejorando la toxicidad de la PE. Pero la complicada manera en la que la PE ejerce su toxicidad hace que la mejora de esa toxicidad sea problemática.

En base a la estructura cristalográfica de la PE (Allured,...

1. Un anticuerpo que se une específicamente a CD22, anticuerpo que comprende:

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 30 y 31 de la cadena V_L es HG.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 30 y 31 de la cadena V_L es GR.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 30 y 31 de la cadena V_L es RG.

5. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 30 y 31 de la cadena V_L es AR.

6. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicha cadena V_L tiene la secuencia de SEC ID N.º 20.

7. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 104, 105 y 106 de la cadena V_H es THW.

8. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 104, 105 y 106 de la cadena V_H es YNW.

9. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 104, 105 y 106 de la cadena V_H es TTW.

10. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de los residuos de las posiciones que corresponden a las posiciones 104, 105 y 106 de la cadena V_H es STY.

11. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicha cadena V_H tiene la secuencia de SEC ID N.º 21.

12. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicha cadena V_L tiene la secuencia de SEC ID N.º 20 y dicha cadena V_H tiene la secuencia de SEC ID N.º 21.

13. El anticuerpo de cualquier reivindicación anterior, anticuerpo que se selecciona del grupo constituido por un scFv, un dsFv, un Fab o un F(ab')₂.

14. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicha cadena V_L tiene la secuencia de SEC ID N.º 20, excepto que dicha cadena V_L tiene una cisteína en lugar de glicina en la posición 100, y dicha cadena V_H tiene la secuencia de SEC ID N.º 21, excepto que la cadena V_H tiene una cisteína en lugar de arginina en la posición 44, siendo además dicho anticuerpo un dsFv.

15. Un anticuerpo que es una forma humanizada del anticuerpo murino de la reivindicación 1.

16. Una molécula quimérica que comprende un resto terapéutico o un marcador detectable conjugado o fusionado con un anticuerpo de cualquier reivindicación anterior.

17. La molécula quimérica de la reivindicación 16, en la que el resto terapéutico se selecciona del grupo constituido por una citotoxina, un fármaco, un radioisótopo o un liposoma cargado con un fármaco o con una citotoxina.

18. La molécula quimérica de la reivindicación 16 o la reivindicación 17, en la que el resto terapéutico es una citotoxina que está conjugada con un anticuerpo y en la que la molécula quimérica es una inmunotoxina.

19. La molécula quimérica de la reivindicación 18, en la que el resto terapéutico es una citotoxina seleccionada del grupo constituido por ricina A, abrina, ribotoxina, ribonucleasa, saporina, caliqueamicina, una toxina de difteria mutada, una exotoxina A de Pseudomonas mutada ("PE") y toxina botulínicas A a F.

20. La molécula quimérica de la reivindicación 19, en la que dicha PE se selecciona del grupo constituido por PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE28QQR.

21. La molécula quimérica de la reivindicación 19, en la que dicha PE mutada tiene una glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina en lugar de arginina en una posición correspondiente a la posición 490 de la SEC ID N.º 24.

22. La molécula quimérica de la reivindicación 21, en la que dicho residuo de arginina de una posición correspondiente a la posición 490 de SEC ID N.º 24 está reemplazado por alanina.

23. Una composición que comprende (a) un vehículo farmacéuticamente aceptable y (b) una molécula quimérica que comprende un anticuerpo conjugado o fusionado con un resto terapéutico o un marcador detectable, anticuerpo que es el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

24. La composición de la reivindicación 23, en la que el resto terapéutico se selecciona del grupo constituido por una citotoxina, un fármaco, un radioisótopo o un liposoma cargado con un fármaco o con una citotoxina, y es opcionalmente una citotoxina seleccionada del grupo constituido por ricina A, abrina, ribotoxina, ribonucleasa, saporina, caliqueamicina, una toxina de difteria mutada, una exotoxina A de Pseudomonas mutada ("PE") y toxinas botulínicas A a F.

25. La composición de la reivindicación 24, en la que dicha PE mutada tiene una glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina en lugar de arginina en una posición correspondiente a la posición 490 de la SEC ID N.º 24 y, opcionalmente, dicho residuo de arginina de la posición correspondiente a la posición 490 de SEC ID N.º 24 está reemplazado por alanina.

26. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

27. Un vector de expresión que comprende un promotor ligado operativamente a un ácido nucleico que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

28. El vector de expresión de la reivindicación 27, en el que además dicho ácido nucleico codifica un polipéptido que es un resto terapéutico o un marcador detectable, en el que dicho resto terapéutico es un fármaco o una citotoxina, y en el que además dicha citotoxina es exotoxina A de Pseudomonas, o un fragmento citotóxico o un mutante de la misma ("PE").

29. Un equipo para detectar la presencia de una célula cancerosa CD22+ en una muestra biológica, equipo que comprende:

30. El equipo de la reivindicación 29, en el que además dicho anticuerpo está fusionado o conjugado con un marcador detectable.

31. Uso de una molécula quimérica de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 para la fabricación de un medicamento destinado a tratar un cáncer que se caracteriza porque las células malignas expresan a CD22.

32. Uso de la reivindicación 31, en el que el cáncer se selecciona entre leucemia linfocítica crónica y leucemia de células vellosas.

33. La molécula quimérica de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 para su uso como una composición farmacéutica.

34. La molécula quimérica de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 para su uso en el tratamiento de un cáncer que se caracteriza porque las células malignas expresan a CD22.

35. La molécula quimérica de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 para su uso en el tratamiento de un cáncer seleccionado entre leucemia linfocítica crónica y leucemia de células vellosas.