Anticuerpo monoclonal que reconoce Enteromyxum scophthalmi, procedimiento y kit de diagnóstico de la enteromixosis del rodaballo.

La presente invención hace referencia a un anticuerpo monoclonal que reconoce Enteromyxum scophthalmi

, procedimiento y kit de diagnóstico de la enteromixosis del rodaballo. La presente invención tiene como objeto el anticuerpo monoclonal VIE1 que reconoce de forma específica, epítopos presentes en las diferentes fases de desarrollo del mixosporidio patógeno del rodaballo. Esta invención también se refiere al procedimiento de diagnóstico de la enteromixosis del rodaballo producida por Enteromyxum scophthalmi, que comprende la adición del anticuerpo a una muestra obtenida de un rodaballo y la detección de dicho anticuerpo. En otro aspecto la invención se refiere a un kit de diagnóstico de la enteromixosis del rodaballo.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201301179.

Solicitante: UNIVERSIDADE DE VIGO.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: GARCÍA ESTÉVEZ,José Manuel, IGLESIAS BLANCO,Raúl, RODRÍGUEZ QUIROGA,Juan José.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/569 (para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/18 (contra materiales animales o humanos)

PDF original: ES-2538552_A1.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención tiene como objeto el anticuerpo monoclonal específico VIE1, para ser utilizado mediante técnicas inmunológicas en el diagnóstico de la enteromixosis del rodaballo producida por E. scophthalmi. La técnica se incluye dentro del ámbito de la 10 acuicultura y, además de su utilidad en el diagnóstico de la enfermedad, el anticuerpo puede ayudar en la caracterización inmunoquímica de los epítopos reconocidos, y a la localización de moléculas que puedan ser de aplicación en la inmunoprotección frente al parásito.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La enteromixosis es una enfermedad parasitaria emergente causada por mixosporidios pertenecientes al género Enteromyxum y que está considerada como la enfermedad más grave que afecta a la piscicultura marina en España. En el rodaballo, está causada por la especie E. scophthalmi que produce un cuadro progresivo de enteritis catarral y emaciación progresiva (síndrome de cabeza hundida) que se encuentra asociado a elevadas 20 mortalidades.

El desarrollo de la infección, en los peces, provoca la destrucción progresiva del epitelio intestinal, lo que se traduce en un estado de desnutrición extrema (caquexia) que lleva finalmente a la muerte del hospedador.

Para realizar un correcto diagnóstico de las enfermedades producidas por mixosporidios se depende de la identificación por microscopía de las formas morfológicas del parásito (esporas) originadas en la fase final de su desarrollo ya que no siempre es fácil observar los estadios intracelulares característicos de su desarrollo.

En el caso de E. scophthalmi, la escasez de esporas en el contenido intestinal de los peces enfermos y la dificultad para diferenciar sus formas plasmodiales iniciales condiciona la aplicación de estas técnicas de diagnóstico microscópico sencillas si no se dispone de un adecuado entrenamiento, y aun teniéndolo, es extremadamente difícil diagnosticar con 35 fiabilidad las infecciones leves o iniciales. A día de hoy, no existe tampoco la posibilidad de utilizar técnicas de cultivo para amplificar la presencia del parásito en las muestras

diagnósticas, ya que, hasta el momento, no se ha podido establecer ningún procedimiento que permita el cultivo de mixosporidios. Este último aspecto, junto con la imposibilidad para aislar correctamente el parásito de las muestras intestinales, condiciona también la posibilidad de establecer y ensayar estrategias de inmunoprofilaxis frente a la infección, para la cual, aunque se han realizado algunos estudios preliminares, no existe todavía ningún tratamiento farmacológico efectivo aplicable a gran escala en explotaciones de acuicultura.

Entre los factores fundamentales que determinan la gravedad de la enteromixosis en el rodaballo están su lento periodo de incubación, que puede llegar a ser de varios meses, acompañado de la dificultad para el diagnóstico en etapas iniciales de la infección, así como su transmisión directa. Por eso cuando se detecta un pez clínicamente enfermo, es altamente probable que el parásito esté ya diseminado por toda la explotación.

Recientemente, el gran impulso experimentado por las tecnologías moleculares, ha permitido el desarrollo de métodos de detección por sondas moleculares basadas en la tecnología del ADN o con anticuerpos policlonales.

Al tratarse de un parásito del tracto digestivo, los principales problemas que presentan las técnicas de biología molecular se encuentran en la presencia de inhibidores de la polimerasa en las muestras fecales, o que la conservación de las muestras biológicas degraden el ADN, o inhiban la PCR. Además, sigue resultando una técnica laboriosa, que requiere cierto equipamiento y el coste continúa siendo alto.

Por otro lado, el empleo de anticuerpos policlonales presenta algún que otro inconveniente como que la mezcla de anticuerpos producida es heterogénea, existe variación en los lotes, el suministro es limitado y la respuesta no es reproducible en otro animal.

Por este motivo, se hace indispensable disponer de un método de diagnóstico rápido, fiable y precoz que permita detectar el parásito en fases tempranas de la infección para poder aplicar rápidamente las oportunas medidas de control. Se hace necesario buscar una solución más económica y menos laboriosa para el diagnóstico de la enteromixosis del rodaballo por E. scophthalmi.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Una realización de la invención es un anticuerpo monoclonal VIE1 que reconoce de forma específica epítopos presentes en el mixosporidio patógeno del rodaballo Enteromyxum

scophthalmi, producido por el hibridoma con número de depósito DSM ACC3197, en adelante anticuerpo de la invención.

El hibridoma DSM ACC3197 ha sido depositado el 04-04-2013 en la autoridad internacional de depósito Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, con dirección en Inhoffenstr. 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania, por la Universidad de Vigo, con dirección en Campus Universitario 36310 Vigo, Pontevedra, España.

El hibridoma ha sido identificado por el depositante mediante la referencia P-VI E1 y recibió el número de depósito DSM ACC3197 por la autoridad internacional de depósito.

El hibridoma DSM ACC3197, productor del anticuerpo monoclonal de ratón VIE1, se ha generado empleando ratones BALB/c inmunizados con formas infectivas del parásito E. scophthalmi.

Como es sabido en el estado de la técnica, los hibridomas secretan, de forma continua e ilimitada, anticuerpos monoclonales específicos (mAbs) con actividad biológica conocida y especificidad constante. La aplicación de estos mAbs puede permitir un diagnóstico rápido por procedimientos metodológicamente sencillos, como la inmunofluorescencia directa o la inmunocromatografía. Los anticuerpos monoclonales cuentan además con una ventaja con respecto a las técnicas moleculares, puesto que pueden ser aplicados directamente a las muestras, sin requerir una extracción previa del ADN.

El anticuerpo monoclonal VIE1 reconoce, de forma específica, epítopos presentes en las diferentes fases de desarrollo del mixosporidio E. scophthalmi en el rodaballo. Por tanto, VIE1 reconoce las esporas de E. scophthalmi y también detecta a este parásito en otras fases iniciales de su desarrollo en el rodaballo (formas/estadios plasmodiales iniciales), permitiendo realizar un diagnóstico temprano de la enfermedad, a diferencia de otros procedimientos diagnósticos del estado de la técnica.

En segundo lugar, VIE1 no reconoce a otros mixosporidios de peces como Myxidium sp., Ceratomyxa sp., Kudoa sp. y Sinuolinea scophthalmi. Consecuentemente, el mAb no presenta reactividad cruzada.

Otra realización de la invención es el anticuerpo de la invención unido a una molécula marcadora. De forma particular, dicha molécula marcadora es isotiocianato de fluoresceína o peroxidasa.

Otra realización de la invención es un procedimiento de diagnóstico de la enteromixosis del rodaballo producida por Enteromyxum scophthalmi, que comprende:

(a) añadir el anticuerpo monoclonal VIE1 producido por el hibridoma con número de depósito DSM ACC3197 a una muestra obtenida de un rodaballo y

(b) detectar la presencia de dicho anticuerpo en dicha muestra, donde la presencia de dicho 10 anticuerpo indica que el rodaballo sufre enteromixosis,

en adelante procedimiento de la invención.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicha muestra de rodaballo está seleccionada del grupo compuesto por raspado de intestino, ciegos pilóneos y fluido 15 intestinal.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicho anticuerpo se detecta utilizando una técnica seleccionada... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Anticuerpo monoclonal VIE1 que reconoce de forma específica epítopos presentes en el mixosporidio patógeno del rodaballo Enteromyxum scophthalmi, producido por el hibridoma con número de depósito DSM ACC3197.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho anticuerpo está unido a una molécula marcadora.

3. Anticuerpo según la reivindicación 2, caracterizado por que dicha molécula marcadora es isotiocianato de fluoresceína o peroxidasa.

4. Procedimiento de diagnóstico de la enteromixosis del rodaballo producida por Enteromyxum scophthalmi, que comprende:

(a) añadir el anticuerpo monoclonal VIE1 producido por el hibridoma con número de depósito DSM ACC3197 a una muestra obtenida de un rodaballo y

(b) detectar la presencia de dicho anticuerpo en dicha muestra, donde la presencia de dicho anticuerpo indica que el rodaballo sufre enteromixosis.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado por que dicha muestra de rodaballo está seleccionada del grupo compuesto por raspado de intestino, ciegos pilóneos y fluido intestinal.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado por que dicho anticuerpo se detecta utilizando una técnica seleccionada del grupo compuesto por inmunofluorescencia directa, inmunofluorescencia indirecta, inmunocromatografía, ELISA, Western Blot y microarrays.

7. Un kit de diagnóstico de la enteromixosis del rodaballo producida por Enteromyxum scopthtalmi, que comprende el anticuerpo monoclonal VIE1 producido por el hibridoma con número de depósito DSM ACC3197.