Anexinas radiomarcadas.

Anexina radiomarcada, donde una molécula de anexina comprende un mínimo de 2 y un máximo de 20 residuos de histidina en su terminal N

, como mínimo dos de los residuos mencionados de histidina son adyacentes o están separados por no más de un aminoácido y están ligados a un radionucleido, no más de un aminoácido que no es fenilalanina, tirosina, leucina, isoleucina, valina, metionina o cisteína,

y en el cual la molécula de anexina lleva uno o más residuos de cisteína en el lado cóncavo de la molécula de anexina y no contiene residuos de cisteína en el lado convexo de la molécula de anexina.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/NL2009/050513.

Solicitante: MosaMedix B.V.

Nacionalidad solicitante: Países Bajos.

Dirección: Monnikendijk 4 4474 ND Kattendijke PAISES BAJOS.

Inventor/es: REUTELINGSPERGER, CHRISTIAAN, PETER, MARIA, MOONEN,PETER JOZEF JACOBUS.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/47 (de mamíferos)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > MEDIDA DE RADIACIONES NUCLEARES O DE RAYOS X (análisis... > Medida de los rayos X, rayos gamma, radiaciones corpusculares... > G01T1/161 (Aplicaciones en el campo de la medicina nuclear, p. ej. contado in vivo )
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones que contienen sustancias radioactivas... > A61K51/08 (Péptidos, p. ej. proteínas)

PDF original: ES-2530228_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Anexinas radiomarcadas Campo de la invención [0001] La invención se refiere a moléculas de anexina que tienen sitios de unión para metales pesados, en particular metales radiactivos. La invención además se refiere al uso de moléculas de anexina radiomarcadas en la formación de imágenes de diagnóstico.

Antecedentes [0002] La formación de imágenes moleculares de la fosfatidilserina biomarcadora (PS) in vivo es importante para el diagnóstico de enfermedades y la evaluación de la eficacia de la terapia. Los agentes detectores de PS eficaces son anexina A5 y sus variantes. La anexina A5 marcada con tecnecio puede ser inyectada en un sujeto y, después, se puede realizar una Tomografía computarizada de emisión monofotónica (SPECT) para evaluar el biomarcador PS. Para valorar el biomarcador PS sensiblemente y específicamente es obligatorio que el complejo entre tecnecio y anexina A5 sea estable in vivo y sea rápidamente sacado de la circulación sanguínea.

Los complejos actuales de tecnecio y anexina A5 se basan en la unión química de Tc (tecnecio) con un sitio no-específico de la molécula de anexina. Por ejemplo, JP2006-316004 divulga un compuesto obtenido mediante la unión de 4'-aminometil-N, N'-trimetileno-dibenzohidroxamida con anexina V a través de un enlazador, este compuesto es capaz de complicar el tecnecio. WO 98/48699 divulga un complejo en el cual Tc99m está unido a la anexina vía succinimidílico nicotinato hidracino (HYNIC) . Tales complejos padecen de estabilidad insuficiente. Además, no es posible dirigir el marcador a un sitio específico de las anexinas, especialmente un sitio que no interfiera con su perfil de afinidad. Jung et al. J. Nucl. Med. 2008 49 (Suplemento 1) :304P, se refiere a una molécula de anexina recombinante marcada con I-124 para formar imágenes de apoptosis utilizando un pequeño animal PET (tomografía de emisión de positrón) .

Resumen de la invención [0004] La presente invención proporciona una variante de anexina nueva con una extensión de su terminal N que contiene residuos de histidina para permitir la formación de complejos estables entre un radionucleido tal como el tecnecio y la anexina y que contiene un residuo de cisteína para permitir el acoplamiento a un agente farmacológico o de diagnóstico. La invención también concierne a tales anexinas que llevan un radionucleido, es decir a anexinas radiomarcadas. La invención además proporciona complejos de anexina radiomarcada para usar en diagnósticos y terapia.

Descripción de la invención [0005] Así, la invención se refiere a una anexina radiomarcada, la cual comprende un mínimo de 2 y un máximo de 20 residuos de histidina en sus terminales N, así como también uno o más residuos de cisteína en el lado cóncavo de la molécula, tal como se define en la reivindicación 1. En particular, la anexina de la invención comprende un mínimo de 3, preferiblemente al menos 4 residuos de histidina en su terminal N. El número máximo no es muy estricto, y prácticamente éste puede ser hasta 12, o preferiblemente hasta 10 o incluso hasta 8 residuos de histidina en la terminal N.

Preferiblemente, los residuos de histidina son contiguos, es decir sin otros aminoácidos entremedias, o con solo un aminoácido entremedias. Este particularmente se aplica a dos o tres residuos de histidina. Así, las secuencias parciales preferidas en las terminales N incluyen H-H; H-H-H; H-X-H; H-X-H-H; H-H-X-H; H-X-H-H; o H-X-H-H. Un aminoácido de intervención X, si está presente en todo caso, no es un aminoácido apolar grande tal como Phe, Tyr, Leu, Ile o Val, o Met o Cys. Preferiblemente, los aminoácidos de intervención, si están presentes en todo caso, son seleccionados de Gly, Ala, Ser, Lys, y Arg, y en casos de dos o más X, estos pueden ser diferentes. De la forma más preferible, la variante de anexina de la invención comprende al menos 3 residuos de histidina contiguos a su terminal N, especialmente al final del todo.

El término "anexina" se refiere a cualquier proteína capaz de unirse a fosfolípidos, especialmente fosfatidilserina (PS) en una manera calcio-dependiente, y partes de la denominada familia de la anexina. Estas sustancias tienen la propiedad de unirse a fosfolípidos cargados negativamente, preferiblemente con una constante de disociación menor que 10-6 M en presencia de iones Ca2+. La familia cubre muchos miembros; información sobre la misma y sobre la proteína y secuencias de nucleótidos pueden por ejemplo encontrarse en http://www.structuralchemistr y . org/annexins/seq/search.php. Una alineación de secuencias de varias anexinas se puede encontrar también en WO 2007/069895. Un ejemplo preferido es anexina A5, con la secuencia de aminoácido de la SEC ID Nº : 7 (figura 1) , pero otras anexinas también pueden usarse para producir y utilizar las variantes de anexina de la invención. Por ejemplo, anexinas A4 y A8 también pueden usarse. Donde se hace referencia a la secuencia de aminoácidos y las posiciones de anexina A5, este también se aplica a las otras anexinas,

especialmente anexinas humanas, por elección de la posición correspondiente. Las posiciones correspondientes son conocidas por los expertos en la materia y pueden ser fácilmente identificadas, por ejemplo utilizando el triplete DAE (Asp-Ala-Glu) en posiciones 19-21 de A5, que se conserva sobre más anexinas, con desviaciones menores en algunas anexinas, por ejemplo a DAQ en A4, A9 y A10. Las anexinas pueden proceder de cualquier especie, preferiblemente ave o mamífero, de forma más preferible mamífero, de la forma más preferible humano.

Las anexinas de tipo salvaje solo tienen un número limitado de residuos de histidina, y nunca dos o más sin o solo otro aminoácido entremedias (H-H o H-X-H) . Por ejemplo, las anexinas de mamífero de tipo salvaje A5 solo contienen residuos de His en posiciones 97, 204 y 266. Por lo tanto, la presencia de entre 2 y 20 residuos de histidina con un máximo de una interviniendo otros aminoácidos es una característica única de las variantes de anexina de la presente invención.

Como se utiliza en este caso, el terminal N de las variantes de anexina comprende la secuencia ascendente del residuo de ácido glutámico (E) en la posición 16 de la SEC ID Nº : 7, o regiones correspondientes en otras anexinas. En particular, las variantes de anexina de la invención tienen las secuencias de terminal N nº 1-6, en orden creciente de preferencia:

X1-ERADAETLRKAMK (SEC ID Nº .1)

X2-GFDERADAETLRKAMK (SEC ID Nº .2)

X3-DFPGFDERADAETLRKAMK (SEC ID Nº .3)

X4-TVTDFPGFDERADAETLRKAMK (SEC ID Noº .4)

X5-LRGTVTDFPGFDERADAETLRKAMK (SEC ID Nº .5)

X6-AQVLRGTVTDFPGFDERADAETLRKAMK (SEC ID Nº .6)

Donde:

Cada X1-X6 comprende entre 2 y 20 residuos de histidina separados por no más de un residuo de aminoácido, y X1 representa una secuencia de al menos 15 aminoácidos; X2 representa una secuencia de al menos 12 aminoácidos; X3 representa una secuencia de al menos 9 aminoácidos; X4 representa una secuencia de al menos 6 aminoácidos; X5 representa una secuencia de al menos 3 aminoácidos; X6 representa una secuencia de al menos 2 aminoácidos.

Aquí, la parte que empieza con el primer E (Glu) de la SEC ID Nº : 1 (= posición 16 en SEC ID nº 7) puede ser diferente en otras anexinas. Por ejemplo, es AMEDAQTLRKAMK en A4 humana, y PDPDAETLYKAMK en A8 humana. Se permiten intercambios de aminoácidos únicos en aquella parte que corresponde con otras anexinas, por ejemplo un intercambio de Glu (E) en la posición 16 por Ala (A) o Pro (P) .

La variante de anexina lleva uno o varios, preferiblemente de uno hasta tres, residuos de cisteína, de la forma más preferible solo un residuo de cisteína, en el lado cóncavo de la molécula de anexina.... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Anexina radiomarcada, donde una molécula de anexina comprende un mínimo de 2 y un máximo de 20 residuos de histidina en su terminal N, como mínimo dos de los residuos mencionados de histidina son adyacentes o están separados por no más de un aminoácido y están ligados a un radionucleido, no más de un aminoácido que no es fenilalanina, tirosina, leucina, isoleucina, valina, metionina o cisteína, y en el cual la molécula de anexina lleva uno o más residuos de cisteína en el lado cóncavo de la molécula de anexina y no contiene residuos de cisteína en el lado convexo de la molécula de anexina.

2. Anexina radiomarcada según la reivindicación 1, donde el radionucleido es seleccionado del grupo consistente en galio 67, galio 68, indio 111, tecnecio 99m, renio 188, cobre 64 y estaño 117m.

3. Anexina radiomarcada según la reivindicación 2, donde el radionucleido es Tecnecio99m. 15

4. Anexina radiomarcada según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende de 3 hasta 10 residuos de histidina en su terminal N.

5. Anexina radiomarcada según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dichos residuos de histidina son 20 localizados más arriba del residuo de Glu en la posición 16 de la SEC ID Nº : 7.

6. Anexina radiomarcada según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que tiene la secuencia de terminal N:

X4-TVTDFPGFDERADAETLRKAMK (SEC ID Nº .4) 25 Donde X4 comprende dichos residuos de histidina y representa una secuencia de al menos 6 aminoácidos.

7. Anexina marcada radiactivamente según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde cualquiera de los aminoácidos en posiciones 1-19, 24, 28.

4. 64.

8. 89.

11. 135, 150.

15. 170.

20. 219.

24. 248, .

28. 294 de la 30 SEC ID Nº : 7 se sustituye por un residuo de cisteína.

8. Anexina radiomarcada según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde dicho residuo de cisteína se acopla a un agente farmacológico.

9. Variante de anexina con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº : 8, donde uno de los aminoácidos en posiciones 7-25, 30, 34.

5. 70.

9. 95.

12. 141, 156.

16. 176.

20. 225.

25. 254 .

28. 300 se sustituye por un residuo de cisteína y el residuo de cisteína en la posición 321 se sustituye por otro aminoácido, y donde el residuo de cisteína sustituida en una de las posiciones 7-25, 30, 34.

5. 70.

9. 95.

12. 141, 156.

16. 176.

20. 225.

25. 254 .

28. 300 es opcionalmente acoplada a un agente farmacéutico o de diagnóstico.

10. Anexina radiomarcada según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que se acopla a un agente farmacológico o de diagnóstico, para usar en el diagnóstico y/o terapia.

11. Anexina radiomarcada según la reivindicación 10, para usar en la creación de imágenes de la muerte celular en 45 una célula nucleada dentro de una región de un sujeto mamífero in vivo.

12. Anexina radiomarcada según la reivindicación 10 o 11, donde dicho uso comprende:

(a) administración de dicha anexina radiomarcada al sujeto,

(b) si es pertinente, posicionar al sujeto en el campo de detección de un dispositivo detector de radiaciones, y

(c) medición de la emisión de radiación del radionucleido en el sujeto, con el dispositivo detector de radiaciones, para construir una imagen de la emisión de radiación,

donde dicha imagen es una representación de la muerte celular en dicha célula nucleada de dicho sujeto mamífero.

13. Anexina radiomarcada según la reivindicación 10 u 11, para uso según la reivindicación 12, donde la cantidad de anexina marcada administrada es de entre aproximadamente 1 y 10 μg de anexina proteína/kg.

14. Anexina radiomarcada según la reivindicación 11, para uso según cualquiera de las reivindicaciones 11-13,

donde dicha región está en la cabeza de dicho sujeto o en una parte de la misma, o en el corazón de dicho sujeto o 60 en una parte del mismo, o en el hígado de dicho sujeto o una parte del mismo.

15. Anexina radiomarcada según la reivindicación 11, para uso según cualquiera de las reivindicaciones 11-14, donde dicha región está en un tumor en dicho sujeto o una parte del mismo, o en un transplante en dicho sujeto o una parte del mismo, o en un sitio isquémico en dicho sujeto o una parte del mismo.