Análisis de ácido nucleico.

Un método para obtener y analizar ARN a partir de una muestra de orina, que comprende las etapas de:

(a) obtener una muestra de orina y procesar previamente la muestra de orina mediante filtración a través de un filtro de 0.8 μm;

(b) obtener una fracción de microvesícula de la muestra de orina procesada previamente mediante ultracentrifugación o concentración por filtración;

(c) lavar la fracción de microvesícula;

(d) extraer el ARN de la fracción de microvesícula;

(e) medir la calidad del ARN de la fracción de microvesícula al determinar la cantidad de rARN 18S y 28s en la extracción con el propósito de evaluar la calidad de la extracción de ARN, donde la detección de 18S-28S rARN en la extracción de ARN indica que la extracción de ARN tiene alto rendimiento y/o alta integridad; y

(f) analizar uno o más ARN a partir de la extracción de ARN de la etapa e) que se ha evaluado como alto rendimiento y/o alta integridad

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2010/042365.

Solicitante: THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 55 FRUIT STREET BOSTON, MA 02114 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: MIRANDA,KEVIN C, RUSSO,LEILEATA M, SKOG,JOHAN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/48 (Material biológico, p. ej. sangre, orina (G01N 33/02, G01N 33/26, G01N 33/44, G01N 33/46 tienen prioridad ); Hemocitómetros (cómputo de glóbulos repartidos sobre una superficie por barrido óptico de la superficie G06M 11/02))

PDF original: ES-2547715_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Análisis de ácido nucleico Campo de la invención

La presente invención se relaciona con los campos generales del análisis de ácido nucleico en sujetos humanos u otros sujetos animales, particularmente la adquisición y análisis de ácidos nucleicos de alta calidad a partir de una muestra biológica, y en particular, de microvesículas.

Antecedentes

Las microvesículas pequeñas desprendidas por células se conocen como "exosomas" (Thery et al., 2002). Se reporta que los exosomas tienen un diámetro de aproximadamente 30-100 nm y se desprenden de muchos tipos de células diferentes, bajo condiciones normales y patológicas (Thery et al., 2002). Los exosomas se forman clásicamente de la invaginación hacia adentro y pinzamiento de la última membrana endosómica. Esto da como resultado la formación de un cuerpo multivesicular (MVB) cargado con vesículas bicapa lípidas pequeñas (~40-100 nm de diámetro), cada una de las cuales contiene una muestra de citoplasma de la célula progenitora (Stoorvogel et al., 2002). La fusión del MVB con la membrana celular resulta en la liberación de estos exosomas de la célula, y su suministro en la sangre, orina u otros fluidos corporales.

Otra categoría de vesículas derivadas de células se conoce como "desprendimiento de microvesículas" (Cocucci et al., 2009). Estas microvesículas, formadas por gemación directa de la membrana plasmática de la célula, son más heterogéneas en tamaño que los exosomas, y exosomas similares, también contienen una muestra del citoplasma de la célula progenitora. Los exosomas y microvesículas desprendidos se coaíslan utilizando técnicas de aislamiento por ultracentrlfugación y ultraflltración, y por lo tanto, se denominarán colectivamente aquí como microvesículas.

Estudios recientes revelan que los ácidos nucleicos dentro de microvesículas tienen una función como blomarcadores. Por ejemplo, Skog et. al. describen, entre otras cosas, el uso de ácidos nucleicos extraídos de microvesículas en suero de pacientes GBM para diagnóstico médico, pronóstico y evaluación de terapia (Skog et al., 2008). Se considera que el uso de ácidos nucleicos extraídos de microvesículas evitan potencialmente la necesidad de blopslas, destacando el enorme potencial diagnóstico de la biología de microvesículas (Skog et al., 2008). Se pueden utilizar exosomas de orina para aislar biomarcadores para cáncer de próstata (Milson et al, 2005, 100, 1603-1607).

En investigación y desarrollo, así como en aplicaciones comerciales de biomarcadores de ácidos nucleicos, es deseable extraer ácidos nucleicos de alta calidad de las muestras biológicas de una manera consistente y confiable. Se describen aquí composiciones de extracciones de ácido nucleico de alta calidad de microvesículas y otras muestras biológicas, métodos de fabricación de dichas extracciones, y métodos de uso de estos ácidos nucleicos de alta calidad en diversas aplicaciones.

Breve resumen de la invención

En un aspecto, la invención es un método para obtener y analizar ARN a partir de una muestra de orina, que comprende las etapas de:

(a) obtener una muestra de orina y procesar previamente la muestra de orina mediante filtración a través de un filtro de 0.8 pm;

(b) obtener una fracción de microvesícula de la muestra de orina procesada previamente mediante ultracentrifugación o concentración por filtración;

(c) lavar la fracción de microvesícula;

(d) extraer ARN de la fracción de microvesícula;

(e) medir la calidad del ARN de la fracción de microvesícula al determinar la cantidad de rARN 18S y 28S en la extracción con el propósito de evaluar la calidad de la extracción de ARN, donde la detección de rARN 18S y 28S en la extracción de ARN indica que la extracción de ARN tiene alto rendimiento y/o alta integridad; y

(f) analizar uno o más ARN a partir de la extracción de ARN de la etapa e) que se ha evaluado como alto rendimiento y/o alta integridad.

También se describe una extracción de ácido nucleico novedosa de una o más microvesículas aisladas de una muestra biológica eucariota, en donde rARN 18S y rARN 28S son detectables en la extracción. Preferiblemente, la

relación cuantitativa de rARN 18S con rARN 28S detectable en extracciones novedosas está dentro del rango de aproximadamente 1: 1 a aproximadamente 1:2; y es preferiblemente aproximadamente 1:2. Las muestras biológicas de las cuales se puede obtener la extracción novedosa incluyen, entre otras cosas, cualquier fluido corporal, preferiblemente orina, suero o plasma, y preferiblemente, son de un mamífero, particularmente un humano. Para las muestras de fluido corporal con una concentración de proteína de menos de 10 mg/ml, tal como orina, la extracción de ácido nucleico novedosa puede comprender adicionalmente una extracción de ácido nucleico que tiene unas cifras de integridad de ARN (en todos los casos, como se obtiene en un Agilent BioAnalyzer o un equivalente del mismo) de más de o igual a 5 y/o puede comprender adicionalmente un rendimiento de ácido nucleico de 20 mi de muestra biológica de más de o igual a 50 pg/ml. De forma similar, para las muestras de fluido corporal con una concentración de proteína de más de 10 mg/ml, tal como suero o plasma, la extracción de ácido nucleico novedosa puede comprender adicionalmente unas cifras de integridad de ARN de más de o igual a 3 y/o puede comprender adicionalmente un rendimiento de ácido nucleico de 1 mi de muestra biológica que es mayor que o Igual a 50 pg/ml.

Adicionalmente se describe un perfil novedoso de ácido nucleico de una o más microvesículas aisladas de una muestra biológica eucarlota, en donde rARN 18S y rARN 28S son detectables en el perfil. Preferiblemente, la relación cuantitativa de rARN 18S con rARN 28S detectable en el perfil novedoso está dentro del rango de aproximadamente 1: 1 a aproximadamente 1:2; y es preferiblemente aproximadamente 1:2. Las muestras biológicas de las cuales se puede obtener el perfil novedoso incluyen, entre otras cosas, cualquier fluido corporal, preferiblemente orina, suero o plasma, y preferiblemente, es de un mamífero, particularmente un humano. Para las muestras de fluido corporal con una concentración de proteína de menos de 10 mg/ml, tal como orina, el perfil novedoso puede comprender adlcionalmente unas cifras de integridad de ARN de más de o igual a 5 y/o puede comprender adlcionalmente un rendimiento de ácido nucleico de 20 mi de muestra biológica de más de o igual a 50 pg/ml. De forma similar, para las muestras de fluido corporal con una concentración de proteína de más de 10 mg/ml, tal como suero o plasma, el perfil novedoso puede comprender adicionalmente unas cifras de integridad de ARN de más de o igual a 3 y/o puede comprender adicionalmente un rendimiento de ácido nucleico de 1 mi de muestra biológica que es mayor que o igual a 50 pg/ml.

También se describe un método para evaluar la calidad de una extracción de ácido nucleico de microvesículas aisladas de una muestra biológica eucariota, que comprende las etapas de: (a) extraer ARN de microvesículas; y (b) medir la calidad del ARN al determinar la cantidad de rARN 18S y 28S en la extracción. Preferiblemente, la relación cuantitativa de rARN 18S con rARN 28S determinada en el método novedoso está dentro del rango de aproximadamente 1: 1 a aproximadamente 1:2; y es preferiblemente aproximadamente 1:2. Las muestras biológicas en las que se puede realizar el método novedoso incluyen, entre otras cosas, cualquier fluido corporal, preferiblemente orina, suero o plasma, y preferiblemente, es de un mamífero, particularmente un humano. Para las muestras de fluido corporal con una concentración de proteína de menos de 10 mg/ml, tal como orina, el método novedoso... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para obtener y analizar ARN a partir de una muestra de orina, que comprende las etapas de:

(a) obtener una muestra de orina y procesar previamente la muestra de orina mediante filtración a través de un filtro de 0.8 pm;

(b) obtener una fracción de microvesícula de la muestra de orina procesada previamente mediante ultracentrlfugaclón o concentración por filtración;

(c) lavar la fracción de microvesícula;

(d) extraer el ARN de la fracción de microvesícula;

(e) medir la calidad del ARN de la fracción de microvesícula al determinar la cantidad de rARN 18S y 28s en la extracción con el propósito de evaluar la calidad de la extracción de ARN, donde la detección de 18S-28S rARN en la extracción de ARN indica que la extracción de ARN tiene alto rendimiento y/o alta Integridad; y

(f) analizar uno o más ARN a partir de la extracción de ARN de la etapa e) que se ha evaluado como alto rendimiento y/o alta integridad.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la fracción de microvesícula se obtiene mediante concentración por filtración.

3. El método de la reivindicación 2, en donde la concentración por filtración comprende pasar la muestra de orina a través de un filtro que tiene un tamaño poro de menos de o igual a 0.8 pm.

4. El método de cualquier reivindicación previa, en donde la muestra de orina o fracción de microvesícula se trata con una ribonucleasa, desoxirribonucleasa, o una combinación de los mismos, antes de la realización del lavado en la etapa c).

5. El método de cualquier reivindicación previa, en donde la etapa c) comprende la adición de un Inhibidor RNasa, antes de extraer el ARN.

6. El método de la reivindicación 5, en donde inhibidor RNasa tiene una concentración de mayor que la concentración [1X]; alternativamente, mayor que o igual a la concentración [5X]; alternativamente, mayor que o igual a la concentración [10X]; alternativamente, mayor que o igual a la concentración [25X]; y alternativamente, mayor que o igual a la concentración [50X],

7. El método de la reivindicación 5 o reivindicación 6, en donde inhibidor RNasa es una proteasa.

8. El método de cualquier reivindicación previa, que comprende adicionalmente determinar una relación cuantitativa de rARN 18S con rARN 28S en la extracción.

9. El método de la reivindicación 8, en donde la relación cuantitativa de rARN 18S con rARN 28S está dentro del rango de aproximadamente 1:1a aproximadamente 1:2.

10. El método de la reivindicación 8 o reivindicación 9, en donde la relación cuantitativa de rARN 18S con rARN 28S es aproximadamente 1:2.

11. El método de la reivindicación 4 comprende:

tratar la fracción de microvesícula con ADNsa para eliminar todo o sustancialmente todo de cualquier ADN ubicado fuera de o sobre la superficie de las microvesículas en la fracción; extraer ARN de la muestra; y analizar el ARN extraído.