Secuencias de nucleótidos y proteínas de un anticuerpo dirigido frente a un epítopo común para ferritínas humanas ácidas y básicas, anticuerpos monoclonales o meléculas semejantes a anticuerpo que comprenden estas secuencias y uso de éstos.

Un anticuerpo anti-ferritina monoclonal quimérico, que se une a ferritina humana tanto ácida como básica,

que comprende:

(a) dos polipéptidos de cadena pesada, comprendiendo cada uno el dominio VH definido en SEQ ID NO: 4; y

(b) dos polipéptidos de cadena ligera, comprendiendo cada uno el dominio VL como se define en SEQ ID NO: 2.

Secuencias de nucleótidos y proteínas de un anticuerpo dirigido frente a un epítopo común para ferritinas humanas ácidas y básicas, anticuerpos monoclonales o moléculas semejantes a anticuerpo que comprenden estas secuencias y uso de éstos.

Campo de la invención 5

La presente solicitud se refiere a anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, a fragmentos de éstos y a moléculas semejantes a anticuerpo que reconocen un epítopo común para isoferritinas humanas ácidas y básicas. Estos anticuerpos anti-ferritina monoclonales quiméricos y humanizados, fragmentos de éstos y moléculas semejantes a anticuerpo pueden usarse en composiciones farmacéuticas para terapia para tomar como diana varias células cancerosas en un mamífero. También se describe un método para administrar anticuerpos anti-ferritina 10 monoclonales, fragmentos de éstos y moléculas semejantes a anticuerpo a células linfáticas, células pancreáticas, células del endotelio linfático, y células hepáticas cancerosas, así como métodos para tratar cáncer pancreático, carcinomas hepatocelulares, sarcoma de Kaposi y linfoma de Hodgkin.

Antecedentes de la invención Es muy conocido que el sistema inmune juega un papel en la progresión del cáncer. La inmunoterapia es un arma 15 bastante nueva pero prometedora en el arsenal de tratamientos anticancerosos. La inmunoterapia del cáncer tiene como objetivo aumentar la capacidad natural del cuerpo para defenderse frente a tumores malignos a través de la estimulación del sistema inmune del paciente mediante varios agentes farmacológicos tales como vacunas, infusiones de células T, infusiones de citoquinas o anticuerpos. Estos agentes farmacológicos pueden actuar estimulando una respuesta antitumoral incrementando el número de células efectoras, produciendo linfoquinas, 20 disminuyendo mecanismos supresores, mejorando la tolerancia a fármacos citotóxicos o quimioterapia y/o alterando las células tumorales para incrementar su inmunogenicidad.

Los anticuerpos monoclonales pueden actuar bien indirectamente reclutando células, lo que se conoce como citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) , o desencadenando directamente la muerte celular, lo que se conoce como toxicidad dependiente de complemento (CDC) . 25

Un ejemplo de toxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) es la inducida por rituximab, un anticuerpo quimérico que tiene como diana el antígeno CD20, expresado en un número significativo de malignidades de células B. La parte constante (Fc) del anticuerpo se une a los receptores Fc encontrados en monocitos, macrófagos y células asesinas naturales, lo que da lugar a la destrucción de las células tumorales. Los monocitos, macrófagos y células asesinas naturales pueden a su vez engullir las células tumorales unidas y destruirlas. Las 30 células asesinas naturales también secretan citoquinas lo que da lugar a la muerte celular.

En la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) , el anticuerpo monoclonal se une a su receptor en las células tumorales e inicia el sistema del complemento, que causa la permeación de la membrana celular dando lugar inevitablemente a la muerte celular.

En otro escenario más, los anticuerpos monoclonales pueden matar a las células bloqueando los mecanismos de 35 crecimiento o desencadenando la apoptosis.

Por lo tanto, los anticuerpos pueden actuar de diferentes maneras para tratar el cáncer. Además, pueden usarse bien solos como se ha descrito anteriormente o pueden acoplase a toxinas, agentes citotóxicos, fármacos, células inmunes asesinas o radioisótopos para administrar una sustancia o compuesto citotóxico a los sitios tumorales. Los ejemplos de radioisótopos que pueden usarse en radioinmunoterapia incluyen radioisótopos que emiten alfa o beta. 40 Un ejemplo de una toxina conjugada a un anticuerpo para uso en terapia de anticuerpo es la exotoxina de pseudomonas. Los ejemplos de fármacos que pueden usarse incluyen agentes alquilantes, fármacos de platino, fármacos de pirimidina y semejantes.

Sin embargo, uno de los problemas encontrados con el uso de terapia de anticuerpo es que los anticuerpos pueden tomar como diana células que expresan un antígeno que puede estar presente tanto en células normales como 45 cancerosas y así existe la posibilidad de reaccionar con células o tejidos normales. La reactividad cruzada con los tejidos normales o células normales puede dar lugar a resultados perjudiciales. Por lo tanto, se buscan generalmente los antígenos específicos de tumor o antígenos sobreexpresados en las células tumorales.

Aunque los anticuerpos monoclonales murinos se producen fácilmente y son generalmente funcionales, son reconocidos como antígenos extraños por un huésped humano y se producen anti-antígenos de ratón humanos 50 (HAMA) . Como se requiere la administración repetida de anticuerpos murinos, dicha administración puede causar efectos inflamatorios sistémicos. Para superar los problemas del uso de anticuerpos monoclonales murinos, se pueden generar anticuerpos humanos directamente a partir de seres humanos. Sin embargo, este proceso causa problemas éticos ya que no se puede pulsar a seres humanos con antígenos con el fin de producir anticuerpos. Además, no es fácil generar anticuerpos humanos frente a tejido humano. Así, se prefiere el uso de anticuerpos 55 quiméricos o humanizados ya que incitan una respuesta menor que la respuesta de anticuerpo anti-ratón humana.

Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos que tienen regiones variables de una especie y regiones constantes de otra especie. Los ejemplos de anticuerpos quiméricos se describen en WO88/04936. Sin embargo, la generación de anticuerpos humanizados introduciendo secuencias humanas es muy difícil e impredecible. Esto se debe a la pérdida significativa de afinidad de unión del injerto de las regiones hipervariables y la alteración de la conformación de la región determinante de la complementariedad (CDR) por el marco humano. Además, aunque los anticuerpos 5 quiméricos pueden generarse in vitro, los ensayos funcionales tales como ensayos CDC y ensayos ADCC no pueden predecir de forma inherente la capacidad in vivo de un anticuerpo quimérico de destruir o deplecionar las células diana que expresan un antígeno específico. Así, en muchos casos, no es predecible si un anticuerpo quimérico o humanizado puede funcionar de hecho apropiadamente para terapia de anticuerpo.

La ferritina es una proteína de almacenamiento de hierro que tiene un peso molecular de 440.000. Está 10 sobreexpresada en algunos tumores tales como cáncer de mama (Guner et al., "Cytosol and serum ferritin in breast carcinoma." Cancer Lett, 67 (2-3) :103-112 (1992) ; Weinstein et al., "Tissue ferritin concentration and prognosis in carcinoma of the breast." Breast Cancer Res Treat; 14 (3) :349-53 (1989) ) , linfoma de Hodgkin (Eshhar et al., "Ferritin, a Hodkin;s disease Associated Antigen." PNAS U.S.A.; 71 (10) :3956-60 (1974) ) y cáncer pancreático (Dr y sdale et al., "Human isoferritins in normal and disease states." Semin Hematol, 14 (1) :71-88 (1977) Marcus et al., 15 "Isolation of ferritin from human mammar y and pancreatic carcinomas by means of antibody immunoadsorbents." Arch Biochem Biophys, 162 (2) :493-501 (1974) ) .

Un suero antiferritina policlonal radiomarcado obtenido por inmunización de conejos con ferritina aislada del bazo de un paciente con enfermedad de Hodgkin mostró actividad antitumoral en pacientes con enfermedad de Hodgkin (Vriesendorp et al., "Radiolabelled immunoglobulin therapy in patients with Hodgkin's disease." Cancer Biother 20 Radiopharm; 15 (5) :431-45 (2000) . Sin embargo, los anticuerpos policlonales tienen varios inconvenientes en comparación con los anticuerpos monoclonales tal como tamaño de lote limitado. De hecho, Vriesendorp y colegas notaron diferencias en las proporciones de respuesta en dos ensayos en pacientes con linfoma de Hodgkin cuando usaron dos lotes diferentes del anticuerpo antiferritina policlonal (Vriesendorp et al., "Review of five consecutive studies of radiolabeled immunoglobulin therapy in Hodgkin's disease." Cancer Res, 55 (23 Supl) : 5888s-92s (1995) . 25 Así, son preferibles los anticuerpos monoclonales para uso en aplicaciones terapéuticas en lugar de anticuerpos policlonales por muchas razones.

La Patente U.S. 7.153.506 describe el uso de anticuerpos anti-ferritina monoclonales murinos para tratar algunas formas de cáncer. Sin embargo, como se ha mostrado anteriormente existen problemas asociados con el tratamiento de seres humanos con anticuerpos monoclonales murinos (tales como producción de HAMA) . 30

WO01/52889 también describe anticuerpos monoclonales y policlonales que se unen a un epítopo... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo anti-ferritina monoclonal quimérico, que se une a ferritina humana tanto ácida como básica, que comprende:

(a) dos polipéptidos de cadena pesada, comprendiendo cada uno el dominio VH definido en SEQ ID NO: 4; y (b) dos polipéptidos de cadena ligera, comprendiendo cada uno el dominio VL como se define en SEQ ID NO: 2. 5

2. El anticuerpo anti-ferritina monoclonal quimérico según la reivindicación 1, en el que cada una de dichas cadenas pesadas comprende además una región constante CH1, que comprende opcionalmente una región Fc humana o una región Fc murina, y/o un péptido señal.

3. El anticuerpo anti-ferritina monoclonal quimérico según la reivindicación 2, en el que dicho péptido señal comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 16. 10

4. El anticuerpo anti-ferritina monoclonal quimérico según la reivindicación 1, en el que cada una de dichas cadenas ligeras comprende además una región constante kappa o lambda y/o un péptido señal.

5. El anticuerpo anti-ferritina monoclonal quimérico según la reivindicación 4, en el que dicha región constante kappa o lambda comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12.

6. El anticuerpo anti-ferritina monoclonal quimérico según la reivindicación 4, en el que dicho péptido señal 15 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14.

7. El anticuerpo anti-ferritina monoclonal quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende como una cadena ligera, desde la parte N-terminal a la parte C-terminal, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 12, y como una cadena pesada, desde la parte N-terminal a la parte C-terminal, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y una región Fc humana. 20

8. Un fragmento funcional del anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho fragmento funcional es un fragmento Fv o un fragmento Fab y en el que dicho fragmento funcional se une específicamente a ferritinas humanas tanto ácidas como básicas.

9. Un anticuerpo monoclonal biespecífico o triespecífico que comprende al menos un fragmento Fab según la reivindicación 8, en el que al menos un fragmento Fab consiste en un polipéptido que consiste desde el extremo N al 25 extremo C en SEQ ID NO: 2 unida directamente a SEQ ID NO: 12 y un polipéptido que consiste desde el extremo N al extremo C en SEQ ID NO: 4 directamente unida a SEQ ID NO: 6.

10. El fragmento funcional según la reivindicación 8, en el que dicho fragmento está unido a un ligando.

11. El fragmento funcional según la reivindicación 10, en el que dicho ligando es una citoquina, un receptor o cualquier proteína de interés. 30

12. Una molécula scFv que consiste en un dominio VH como se define en SEQ ID NO: 4, unido a un dominio VL como se define en SEQ ID NO: 2, en el que dicha molécula scFv se une a ferritinas humanas tanto ácidas como básicas.

13. Una molécula que es un fragmento divalente que comprende al menos un dominio VH como se define en SEQ ID NO: 4 y al menos un dominio VL como se define en SEQ ID NO: 2, en el que dicha molécula que es un fragmento 35 divalente se une a ferritinas humanas tanto ácidas como básicas.

14. Un anticuerpo anti-ferritina monoclonal murino que se une a ferritina humana tanto ácida como básica que comprende como una cadena ligera, desde la parte N-terminal a la parte C-terminal, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 12, y como una cadena pesada, desde la parte N-terminal a la parte C-terminal, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y una región Fc murina. 40

15. Una molécula seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo anti-ferritina monoclonal quimérico, un fragmento funcional, un anticuerpo monoclonal biespecífico, un anticuerpo monoclonal triespecífico y una molécula scFv según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, un Bis-scFv que comprende al menos un scFv según la reivindicación 12 y un fragmento divalente según la reivindicación 13, que comprende además un radioisótopo conjugado con él. 45

16. La molécula según la reivindicación 14, en la que dicho radioisótopo es un radioisótopo que emite alfa, beta, gamma, beta-gamma o alfa-beta.

17. Una molécula seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo anti-ferritina monoclonal quimérico, un fragmento funcional, un anticuerpo monoclonal biespecífico, un anticuerpo monoclonal triespecífico y una molécula scFv según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, un Bis-scFv que comprende al menos un scFv según la 50

reivindicación 12 y un fragmento divalente según la reivindicación 13, que comprende además un fármaco conjugado con él.

18. La molécula según la reivindicación 17, en la que dicho fármaco es un fármaco de pirimidina.

19. Una composición farmacéutica que comprende una molécula seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo anti-ferritina monoclonal quimérico o humano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un 5 fragmento funcional según la reivindicación 8, un anticuerpo monoclonal biespecífico o triespecífico según la reivindicación 9, una molécula scFv según la reivindicación 12, un Bis-scFv que comprende una molécula scFv según la reivindicación 12 y un fragmento divalente según la reivindicación 13, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. La composición según la reivindicación 19, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que un fármaco, 10 materiales radiactivos, toxinas, células inmunes asesinas o combinaciones de éstos se une a través de un agente quelante o un conector a dicho anticuerpo anti-ferritina monoclonal quimérico, fragmento funcional, anticuerpo monoclonal biespecífico o triespecífico, molécula scFv, Bis-scFv o fragmento divalente, para uso como un agente terapéutico.

21. La composición según la reivindicación 19, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, para administración 15 simultáneamente o a intervalos específicos con una composición seleccionada del grupo de un fármaco, materiales radiactivos, toxinas, células inmunes asesinas y combinaciones de éstos, en el tratamiento de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer pancreático, linfoma de Hodgkins, sarcoma de Kaposi y carcinoma hepatocelular.

22. Un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una cadena pesada según una cualquiera de las 20 reivindicaciones 1 a 7 y un ácido nucleico que codifica una cadena ligera según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y que comprende opcionalmente un promotor de expresión de baculovirus o un promotor eucariota.

23. El vector según la reivindicación 22, en el que dicho ácido nucleico que codifica la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 3 y en el que dicho ácido nucleico que codifica la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 1. 25

24. Células transformadas con un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 22 ó 23 en el que dichas células se seleccionan del grupo que consiste en células CHO, E. coli, células de levadura, células VERO, células HELA, células COS, células CR: 1650, W138, BHK, HepG2, 3T3, A549, PC12, K562, células 293, células Sf9 y células Cv1.

25. Células transformadas con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una cadena pesada según 30 una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una cadena ligera según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, seleccionadas en particular del grupo que consiste en células CHO, E. coli, células de levadura, células VERO, células HELA, células COS, células CR: 1650, W138, BHK, HepG2, 3T3, A549, PC12, K562, células 293, células Sf9 y células Cv1.

26. Las células según una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 25, en las que dicho ácido nucleico que codifica la 35 cadena pesada comprende SEQ ID NO: 3, y en las que dicho ácido nucleico que codifica la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 1.