Variantes de beta-glucosidasa recombinante para la producción de azúcares solubles de biomasa celulósica.

Una variante de polipéptido de ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína C1 natural (Bgl1) y que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a ß-glucosidasa C1 natural (residuos 20-870 de SEC ID Nº:

2) y tiene al menos una sustitución en la posición D369 en la que la posición se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a la expresión de variantes de º-glucosidasa recombinantes y a su uso en la producción de azúcares solubles de biomasa celulósica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La biomasa celulósica es un recurso renovable significativo para la generación de azúcares solubles. Estos azúcares pueden usarse como reactantes en diversos procedimientos metabólicos, que incluyen fermentación, para producir biocombustibles, compuestos químicos y otros productos comercialmente valiosos. Aunque la fermentación de azúcares simples tales como glucosa en etanol es relativamente directa, la conversión eficaz de biomasa celulósica en azúcares solubles es exigente (véase, por ejemplo, Ladisch y col., 1983, Enzyme Microb. Technol. 5:82) . La celulosa puede pretratarse químicamente, mecánicamente, enzimáticamente o de otras formas para aumentar la susceptibilidad de celulosa a la hidrólisis. Tal pretratamiento puede ir seguido de la conversión enzimática de celulosa a celobiosa, celo-oligosacáridos, glucosa y otros azúcares y polímeros de azúcar, usando enzimas que rompen los enlaces glucosídicos º-1-4 de celulosa. Estas enzimas se denominan conjuntamente “celulasas”.

Las celulasas se dividen en tres subcategorías de enzimas: 1, 4-º-D-glucano glucanohidrolasa (“endoglucanasa” o “EG”) ; 1, 4-º-D-glucano celobiohidrolasa (“exoglucanasa”, “celobiohidrolasa”, o “CBH”) ; y º-D-glucósidoglucohidrolasa (“º-glucosidasa”, “celobiasa” o “BGL”) . Las endoglucanasas rompen enlaces internos y alteran la estructura cristalina de la celulosa, exponiendo cadenas de polisacárido de celulosa individuales (“glucanos”) . Las celobiohidrolasas acortan gradualmente las moléculas de glucano, liberando principalmente unidades de celobiosa (un dímero de glucosa ligado en º-1, 4 soluble en agua) , además de glucosa, celotriosa y celotetraosa. Las ºglucosidasas fraccionan celobiosa en monómeros de glucosa.

Las celulasas con propiedades mejoradas para su uso en el procesamiento de biomasa celulósica reducirían los costes y aumentarían la eficiencia de producción de biocombustibles y otros compuestos comercialmente valiosos.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En un aspecto, la invención proporciona una variante de º-glucosidasa aislada o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 60 % idéntica, algunas veces al menos aproximadamente el 65 % idéntica y frecuentemente al menos aproximadamente el 70 % idéntica a los residuos 20870 de SEC ID Nº: 2 (º-glucosidasa C1 natural) , o que está codificada por un ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones rigurosas con SEC ID Nº: 1 o el complemento exacto de SEC ID Nº: 1, y que tiene al menos una sustitución, con respecto a SEC ID Nº: 2, de un residuo de aminoácido descrito en el presente documento, en la que la variante tiene mayor actividad de º-glucosidasa que la proteína natural y/o es más termoestable que la proteína natural. También se proporcionan polinucleótidos que codifican las variantes de º-glucosidasa, vectores de expresión que comprenden dichos polinucleótidos y células huésped transformadas con los vectores de expresión.

La invención también proporciona un procedimiento de producción de una variante de º-glucosidasa cultivando una célula huésped transformada con un polinucleótido que codifica una variante de º-glucosidasa en condiciones adecuadas para la expresión de la º-glucosidasa. En algunas realizaciones, el polipéptido de º-glucosidasa se recupera del medio de cultivo o de las células transformadas y cultivadas.

La invención también proporciona una composición de enzima que comprende una variante de º-glucosidasa C1 aislada o recombinante. Opcionalmente, la composición de enzima también incluye al menos una enzima celulasa adicional.

En un aspecto relacionado y/u otros aspectos, la invención proporciona un procedimiento de conversión de un sustrato de biomasa, tal como celobiosa, en un azúcar fermentable poniendo en contacto una variante de ºglucosidasa con el sustrato de biomasa en condiciones adecuadas para la producción del azúcar fermentable. En una realización, el sustrato de biomasa se mantiene en un medio que contiene células que expresan una variante de º-glucosidasa. En una realización, la célula huésped recombinante que expresa una variante de º-glucosidasa también expresa al menos otra celulasa recombinante y/u otra enzima. Opcionalmente, el sustrato de biomasa se pretrata antes de poner en contacto el sustrato con una variante de polipéptido de º-glucosidasa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. (A) Termoestabilidades de variantes de Bgl1 C1 mejoradas producidas en la cepa C1; la actividad enzimática residual después de 6 h de incubación a pH 5, 65 ºC se determinó por ensayo de pNPG a pH 5, 50 ºC

durante 20 min. N = 6-8; las barras de error representan ± 1 desviación estándar. (B) Termoestabilidades de variantes de Bgl1 C1 mejoradas producidas en la cepa C1; la actividad enzimática residual después de 24 h de incubación a pH 5, 65 ºC se determinó por ensayo de pNPG a pH 5, 50 ºC durante 20 min. N = 6-30; las barras de error representan ± 1 desviación estándar. (C) Correlación de termoestabilidad de Bgl1 C1 entre levadura y huéspedes C1. Figura 2. (A) Las termoestabilidades de las variantes de Bgl1 C1 mejoradas 481, 269 y 3 se compararon con las de la enzima Bgl1 C1 nativa. La actividad enzimática residual después de 24 h de incubación a pH 4, 5, 65 ºC se midió usando pNPG como sustrato a pH 5, 50 ºC durante 20 min. N=6-16; las barras de error representan ± 1 desviación estándar. (B) La termoestabilidad de la variante de Bgl1 C1 mejorada 664 se comparó con la de la variante 481. La actividad enzimática residual después de 4 h de incubación a pH 4, 65 ºC se midió usando pNPG como sustrato a pH 5, 50 ºC durante 20 min. N=6-24; las barras de error representan ± 1 desviación estándar. Figura 3. Las termoestabilidades de las variantes de Bgl1 C1 mejoradas 3, 481, 664, 916, 885 y 871 se compararon con las de la enzima Bgl1 C1 nativa. La actividad enzimática residual después de 72 h de incubación a pH 4, 5, 65 ºC se midió usando pNPG como sustrato a pH 5, 50 ºC durante 20 min. N=6-10; las barras de error representan ± 1 desviación estándar. Figura 4. La actividad específica de Bgl1 C1 nativa se comparó con la de la variante 871 en un ensayo de celobiosa. Condiciones de ensayo: pH 4, 5-5, temperaturas 55 ºC-75 ºC; 8 g/l de celobiosa, 18 h de reacción. La concentración de proteína se normalizó en reacciones. N+2; las barras de error representan ± 1 desviación estándar. Figura 5. La Figura 5 muestra un alineamiento de secuencia de aminoácidos de Bgl1 C1 nativa (SEC ID Nº: 2) con las secuencias de aminoácidos de las variantes 3 (SEC ID Nº: 5) , 269 (SEC ID Nº: 7) , 481 (SEC ID Nº: 9) , 647 (SEC ID Nº: 15) , 664 (SEC ID Nº: 13) , 871 (SEC ID Nº: 17) , 885 (SEC ID Nº: 19) y 916 (SEC ID Nº: 21) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

I. DEFINICIONES

Las siguientes definiciones se proporcionan para ayudar al lector. A menos que se defina de otro modo, todos los términos de la materia pretenden tener los significados comúnmente entendidos por aquellos expertos en las materias de biología molecular y microbiología. En algunos casos, términos con significados comúnmente entendidos se definen en el presente documento para claridad y/o para facilitar la referencia, y la inclusión de tales definiciones en el presente documento no debe interpretarse necesariamente que represente una diferencia sustancial con respecto a la definición del término como generalmente se entiende en la materia.

El término “celulasa” se refiere a una categoría de enzimas que puede hidrolizar celulosa ( -1, 4-glucano o enlaces D-glucosídicos) a oligosacáridos más cortos, celobiosa y/o glucosa.

Los términos “ -glucosidasa” y “celobiasa” se usan indistintamente y se refieren a una -D-glucósido glucohidrolasa que cataliza la hidrólisis de un dímero de azúcar, que incluye, pero no se limita a, celobiosa, con la liberación de un monómero de azúcar correspondiente. En una realización, una -glucosidasa es una -glucosidasa glucohidrolasa de la clasificación E.C. 3.2.1.21 que cataliza la hidrólisis de celobiosa en glucosa. Algunas de las -glucosidasas tienen la capacidad para también hidrolizar -D-galactósidos, -L-arabinósidos y/o -D-fucósidos y adicionalmente algunas -glucosidasas pueden actuar sobre a-1, 4-sustratos tales como almidón. La actividad de -glucosidasa... [Seguir leyendo]

1. Una variante de polipéptido de -glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína C1 natural (Bgl1) y que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 70 % idéntica a -glucosidasa C1 natural (residuo.

2. 870 de SEC ID Nº: 2) y tiene al menos una sustitución en la posición D369 en la que la posición se determina por alineamiento óptimo con SEC ID Nº: 2.

2. La variante de polipéptido de -glucosidasa según la reivindicación 1, en la que el aminoácido en la posición 369 está seleccionado del grupo que consiste en R, Q, L, Y, C, A, I, P, E, K, F, M, H y V, opcionalmente en la que, con respecto a una Bgl1 C1 nativa que comprende los aminoácido.

2. 870 de SEC ID Nº: 2, la variante tiene:

a) al menos 5 veces mayor termoactividad a aproximadamente pH 5 y aproximadamente 65 ºC, b) al menos 3 veces mayor termoestabilidad a aproximadamente pH 5 y aproximadamente 65 ºC, o c) tanto (a) como (b) .

3. La variante de polipéptido de -glucosidasa según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la secuencia de aminoácidos incluye Q291W, D369R/H/L/Y y E402N y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q258N/H, I106V, E385L, D274Y, K495H/I/N/Q, Q119E, Y135Q, G628W, N437I/V/W/D, S501R, Q313M, S434P y Y491F.

4. La variante de polipéptido de -glucosidasa según la reivindicación 1 que tiene al menos el 70 % de identidad, al menos el 75 % de identidad, al menos el 80 % de identidad, al menos el 85 % de identidad, al menos el 90 % de identidad o al menos el 95 % de identidad con los residuos de aminoácido.

2. 870 de SEC ID Nº: 2 y comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Q291, una sustitución de aminoácidos en la posición D369 y una sustitución de aminoácidos en la posición E402, como se determina con referencia a SEC ID Nº: 2.

5. La variante de polipéptido de -glucosidasa de la reivindicación 4, que comprende además al menos una sustitución de aminoácidos adicional en D47, A79, Q85, I106, A109, Q258, V260, Q313, F314, A343, S434, A475, K495, G628, A689, Y715 o A732, en la que la sustitución es opcionalmente D471, A79E/G/M, Q85N/H, I106V, A109/S/T, V260G, Q313M, F314L/V, A343C, S434P, A475L, K495N, G628W, A689I, Y715P o A732G, tal como en la que la variante comprende al menos una sustitución Q291W, D369R/L/H/Y o E402N.

6. La variante de polipéptido de -glucosidasa de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en la que, con respecto a una Bgl1 C1 nativa que comprende los aminoácido.

2. 870 de SEC ID Nº: 2, la variante tiene:

a) al menos 5 veces mayor termoactividad a aproximadamente pH 5 y aproximadamente 65 ºC, b) al menos 3 veces mayor termoestabilidad a aproximadamente pH 5 y aproximadamente 65 ºC, o c) tanto (a) como (b) .

7. La variante de polipéptido de -glucosidasa de cualquier reivindicación precedente que tiene al menos el 75 % de identidad, al menos el 80 % de identidad, al menos el 85 % de identidad, al menos el 90 % de identidad, al menos el 91 % de identidad, al menos el 92 % de identidad, al menos el 93 % de identidad, al menos el 94 % de identidad, al menos el 95 % de identidad, al menos el 96 % de identidad, al menos el 97 % de identidad, al menos el 98 % de identidad o al menos el 99 % de identidad con los residuos de aminoácido.

2. 870 de SEC ID Nº: 2.

8. La variante de polipéptido de -glucosidasa según la reivindicación 1 que comprende los residuos de aminoácido.

2. 870 de una secuencia seleccionada de SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7; SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 13; SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 19 y SEC ID Nº: 21.

9. Un ácido nucleico recombinante que codifica una variante de polipéptido de -glucosidasa de cualquier reivindicación precedente, opcionalmente en el que el ácido nucleico codifica una preproteína que comprende la variante de Bgl1 fusionada con un péptido señal, opcionalmente el péptido señal Bgl1 C1 que se produce naturalmente.

10. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico recombinante de la reivindicación 9.

11. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico recombinante de la reivindicación 10, en la que dicho ácido nucleico está opcionalmente operativamente ligado a un promotor distinto del promotor de Bgl1 C1, por ejemplo, en la que:

a) la célula huésped es una especie de hongo filamentoso tal como una especie de Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Chr y sosporium, Myceliophthora o Thielavia; o b) la célula huésped también expresa al menos un polipéptido de celulasa recombinante que no se produce naturalmente adicional, seleccionado de:

i) un polipéptido de endoglucanasa (EG) recombinante, y ii) un polipéptido de celobiohidrolasa (CBH) recombinante.

12. Un procedimiento de producción de un polipéptido de Bgl1 que comprende cultivar una célula huésped de la reivindicación 11 en condiciones en las que se expresa la variante de Bgl1, tales como en las que la variante es secretada por la célula huésped, opcionalmente que comprende además una etapa de recuperar la variante de Bgl1 del medio en el que se cultiva la célula.

13. Una composición que comprende una variante de Bgl1 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y al menos una polipéptido de celulasa recombinante que no se produce naturalmente adicional, seleccionado de

a) un polipéptido de endoglucanasa (EG) recombinante; b) un polipéptido de celobiohidrolasa (CBH) recombinante; y c) al menos un polipéptido de EG recombinante y al menos un polipéptido de CBH recombinante, opcionalmente:

i) que comprende además al menos un polipéptido seleccionado de un grupo de polipéptidos que consiste en una hemicelulasa, una pectinasa, una lignina peroxidasa, una manganeso peroxidasa, una lacasa y una celobiosa deshidrogenasa; ii) en la que la celobiohidrolasa (CBH) y/o endoglucanasa (EG) es de Trichoderma reesei, Myceliophthora thermophila o Streptomyces avermitilis, o es una variante de una CBH o EG de T. reesei, CBH o EG de M. thermophila o una CBH o EG de S. avermitilis; o iii) que comprende una célula huésped que expresa la variante de Bgl1.

14. El uso de una variante de Bgl1 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en la producción de azúcares solubles de biomasa celulósica.

15. El uso de la reivindicación 14 que es un procedimiento de producción de glucosa que comprende combinar celobiosa con una variante de -glucosidasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y opcionalmente al menos una celulasa adicional, en condiciones en las que se produce glucosa, por ejemplo, que comprende además:

a) cultivar un microorganismo en condiciones en las que la glucosa producida se usa como una fuerte de energía y carbono para producir un producto metabólico; y b) recuperar el producto metabólico,

opcionalmente en el que: i) el microorganismo es una levadura o bacteria; o ii) el producto metabólico es un alcohol, ácido orgánico o hidrocarburo con 1-20 átomos de carbono, por ejemplo, en el que el producto metabólico es etanol.