Promotores del gen de las plantas de tipo MtN3 inducibles por nemátodos y elementos reguladores relacionados.

Un promotor que comprende un polinucleótido del promotor aislado,

capaz de mediar la expresión específica de laraíz y/o inducible por nemátodos, en donde el polinucleótido del promotor se selecciona del grupo de polinucleótidosque consiste de:

a) un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1 ó 3;

b) un polinucleótido que comprende los nucleótidos 748 a 998, o los nucleótidos 500 a 998, o los nucleótidos 573 a922 de un polinucleótido que tiene la secuencia como la expuesta en la SEQ lD NO: 1;

c) un polinucleótido que comprende los nucleótidos 400 a 609, o los nucleótidos 260 a 609, o los nucleótidos 200 a609 de un polinucleótido que tiene la secuencia como la expuesta en la SEQ lD NO: 3;

d) un polinucleótido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con cualquiera de los polinucleótidos de a)hasta c);

e) un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas a cualquiera de los polinucleótidos de a) hasta c);

f) un polinucleótido que comprende un fragmento de al menos 50 nucleótidos consecutivos, o al menos 100nucleótidos consecutivos, o al menos 200 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido que tiene una secuenciacomo la expuesta en SEQ ID NO: 1 o 3.

Promotores del gen de las plantas de tipo MtN3 inducibles por nemátodos y elementos reguladores relacionados Campo de la invención La presente invención se relaciona con secuencias de promotores y elementos reguladores que regulan la transcripción de genes similares a los genes de tipo MtN3. Los promotores de genes de tipo MtN3 de la invención son útiles para controlar la transcripción de cualquier ácido nucleico de interés en las raíces de las plantas. En particular, los promotores de la invención se pueden utilizar para controlar la transcripción de ácidos nucleicos que codifican agentes que interrumpen la formación o el mantenimiento del sitio de alimentación, que interrumpen el crecimiento y/o la reproducción de nemátodos parasitarios de las plantas, que confieren o mejoran la resistencia de la planta a nemátodos parasitarios de las plantas, o que son tóxicos para los nemátodos parasitarios de las plantas a fin de reducir la destrucción de los cultivos.

Antecedentes de la invención Los nemátodos son gusanos redondos microscópicos que se alimentan en las raíces, hojas y tallos de más de 2.000 cultivos en hileras, hortalizas, plantas frutales y ornamentales, causando una pérdida a nivel mundial de cultivos calculada en $100 mil millones de dólares. Diversas especies de nemátodos parasitarios infectan las plantas de cultivo, incluyendo nemátodos de los nudos radiculares (RKN por sus siglas en inglés) , nemátodos formadores de quistes y lesiones. Los nemátodos de los nudos radiculares, que se caracterizan por provocar la formación de agallas radiculares en los lugares de alimentación, tienen una variedad de huéspedes relativamente amplia y, por lo tanto, son patógenos en una gran cantidad de especies de cultivo. Las especies de nemátodos formadores de quistes y lesiones tienen una variedad de huéspedes más limitada, pero aún así causan pérdidas considerables en los cultivos susceptibles a ellos.

Los nemátodos patógenos se encuentran presentes en todo el territorio de Estados Unidos, pero las mayores concentraciones se presentan en las regiones cálidas y húmedas del sur y oeste, y en los suelos arenosos. Los nemátodos de quiste de la soja (Heterodera glycines) , la plaga más grave de las plantas de soja, se descubrieron por primera vez en Estados Unidos en Carolina del Norte en 1954. Algunas áreas se encuentran tan infestadas por el nemátodo de quiste de Ia soja (SCN por sus siglas en inglés) que la producción de soja ya no es posible económicamente sin implementar medidas de control. A pesar de que la soja es el principal cultivo de importancia económica atacado por el SCN, el SCN parasita alrededor de cincuenta huéspedes en total, incluso cultivos de campo, hortalizas, plantas ornamentales y malezas.

Los signos del daño causado por nemátodos incluyen retraso en el crecimiento y amarillamiento de las hojas, y el marchitamiento de las plantas durante periodos de calor. Sin embargo, la infestación por nemátodos puede causar pérdidas de rendimiento significativas sin que aparezca ningún síntoma evidente de la enfermedad en las partes que se encuentran sobre el nivel del suelo. Las causas principales de la disminución del rendimiento se deben a los daños en la raíz por debajo del nivel del suelo. Las raíces infectadas por el SCN se vuelven pequeñas o se retrasa su crecimiento. La infestación por nemátodos también puede disminuir la cantidad de nódulos de fijación de nitrógeno en las raíces, y puede hacer que las raíces se vuelvan más susceptibles a los ataques por parte de otros patógenos de las plantas que se originan en el suelo.

El ciclo de vida del nemátodo tiene tres etapas principales: huevo, juvenil y adulta. El ciclo de vida varía entre las especies de nemátodos. Por ejemplo, el ciclo de vida del SCN usualmente se completa de 24 a 30 días en condiciones óptimas, mientras que otras especies pueden demorar un año, o más, para completar su ciclo de vida. Cuando los niveles de humedad y temperatura se vuelven adecuados durante la primavera, los jóvenes con forma de gusano eclosionan de los huevos en el suelo. Sólo los nemátodos en la etapa de desarrollo juvenil son capaces de infectar las raíces de la soja.

El ciclo de vida del SCN ha sido objeto de muchos estudios y, por lo tanto, son un ejemplo útil para comprender el ciclo de vida del nemátodo. Luego de penetrar las raíces de la soja, los SCN juveniles se mueven a través de la raíz hasta que entran en contacto con el tejido vascular, momento en el cual dejan de migrar y comienzan a alimentarse. Con un estilete, el nemátodo inyecta secreciones que modifican ciertas células de la raíz y las transforman en sitios de alimentación especializados. Las células de la raíz son transformadas morfológicamente en grandes sincitios de múltiples núcleos (o células gigantes en el caso de RKN) , que se utilizan como fuente de nutrientes para los nemátodos. Los nemátodos que se alimentan activamente roban de esta forma nutrientes esenciales de la planta causando pérdidas de rendimiento. A medida que los nemátodos hembra se alimentan, se hinchan y eventualmente se vuelven tan grandes que sus cuerpos atraviesan el tejido radicular y quedan expuestos en la superficie de la raíz.

Luego de un período de alimentación, los nemátodos SCN macho, que no se hinchan en su adultez, migran fuera de la raíz hacia el suelo y fertilizan a las hembras adultas agrandadas. Los machos mueren después, mientras que las

hembras permanecen unidas al sistema radicular y continúan alimentándose. Los huevos en las hembras hinchadas comienzan a desarrollarse, inicialmente en una masa o saco de huevos fuera del cuerpo y luego dentro de la cavidad corporal del nemátodo. Eventualmente, toda la cavidad corporal de la hembra adulta se llena de huevos, y el nemátodo muere. Es el cuerpo lleno de huevos de la hembra muerta el que se denomina quiste. Los quistes finalmente se liberan y se los encuentra sueltos en el suelo. Las paredes del quiste se vuelven muy duras, brindando una excelente protección para los aproximadamente 200 a 400 huevos que contiene en su interior. Los huevos de SCN sobreviven dentro del quiste hasta que se dan las condiciones adecuadas para su eclosión. Aunque muchos de los huevos pueden eclosionar en el transcurso del primer año, muchos también sobrevivirán en los quistes protectores durante varios años.

Un nemátodo puede moverse por el suelo sólo unas pocas pulgadas por año por sus propios medios. Sin embargo, la infestación por nemátodos se puede expandir por grandes distancias en una variedad de formas. Cualquier cosa que pueda mover suelo infestado es capaz de esparcir la infestación, incluso la maquinarias, vehículos y herramientas agrícolas, viento, agua, animales y trabajadores agrícolas. Las partículas de suelo del tamaño de semillas a menudo contaminan la semilla cosechada. En consecuencia, la infestación por nemátodos se puede esparcir cuando las semillas contaminadas de campos infestados se siembran en campos no infestados. Incluso existe evidencia de que ciertas especies de nemátodos se pueden esparcir a través de las aves. Sólo se pueden prevenir algunas de estas causas.

Las prácticas tradicionales para controlar la infestación por nemátodos incluyen: mantener los niveles adecuados de nutrientes y pH del suelo en las tierras infestadas por nemátodos; controlar otras enfermedades de las plantas, así como también plagas de insectos y malezas; utilizar prácticas sanitarias tales como arar, plantar y cultivar los campos infestados por nemátodos sólo luego de trabajar los campos no infestados; lavar muy bien el equipo con agua o vapor a alta presión luego de trabajar en campos infestados; no utilizar semillas que crezcan en tierras infestadas para sembrar en campos no infestados a menos que la semilla haya sido limpiada de forma adecuada; rotar los campos infestados y alternar los cultivos hospederos con cultivos no hospederos; utilizar nematicidas; y plantar variedades de plantas resistentes.

Se han propuesto métodos para la transformación genética de plantas a fin de conferir mayor resistencia a los nemátodos parasitarios de las plantas. Las patentes estadounidenses Nos. 5.589.622 y 5.824.876 están orientadas a la identificación de genes de las plantas que se expresan específicamente en o cerca del sitio de alimentación de la planta luego de Ia unión del nemátodo. Las patentes estadounidenses Nos. 5.589.622 y 5.824.876 divulgan ocho promotores aislados de raíces de patata infectadas por Globodera rostochiensis: no se divulgan promotores inducibles por nemátodos de otras especies vegetales. Se considera que estos promotores son útiles para dirigir la expresión específica de proteínas o enzimas tóxicas, o la expresión de ARN antisentido para... [Seguir leyendo]

1. Un promotor que comprende un polinucleótido del promotor aislado, capaz de mediar la expresión específica de la raíz y/o inducible por nemátodos, en donde el polinucleótido del promotor se selecciona del grupo de polinucleótidos que consiste de:

a) un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1 ó 3;

b) un polinucleótido que comprende los nucleótidos 748 a 998, o los nucleótidos 500 a 998, o los nucleótidos 573 a 922 de un polinucleótido que tiene la secuencia como la expuesta en la SEQ lD NO: 1;

c) un polinucleótido que comprende los nucleótidos 400 a 609, o los nucleótidos 260 a 609, o los nucleótidos 200 a 609 de un polinucleótido que tiene la secuencia como la expuesta en la SEQ lD NO: 3;

d) un polinucleótido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con cualquiera de los polinucleótidos de a) hasta c) ;

e) un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas a cualquiera de los polinucleótidos de a) hasta c) ;

f) un polinucleótido que comprende un fragmento de al menos 50 nucleótidos consecutivos, o al menos 100 nucleótidos consecutivos, o al menos 200 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en SEQ ID NO: 1 o 3.

2. Un casete de expresión que comprende un polinucleótido del promotor de la reivindicación 1, que comprende además uno o más polinucleótidos operativamente enlazados.

3. EI casete de expresión de la reivindicación 2, en donde dicho polinucleótido operativamente enlazado codifica un agente que interrumpe el metabolismo, el crecimiento y/o la reproducción de un nemátodo que parasita una planta, que confiere o mejora Ia resistencia de la planta a un nemátodo que la parasita, o que es tóxico para un nemátodo que parasita la planta.

4. Una planta transgénica transformada con un casete de expresión, en donde el casete de expresión comprende un polinucleótido aislado del promotor, capaz de mediar la expresión específica de la raíz y/o inducible por nemátodos, en donde el polinucleótido del promotor se selecciona del grupo de polinucleótidos que consiste de:

a) un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1 ó 3;

b) un polinucleótido que comprende los nucleótidos 748 a 998, o los nucleótidos 500 a 998, o los nucleótidos 573 a 922 de un polinucleótido que tiene la secuencia como la expuesta en la SEQ lD NO: 1;

c) un polinucleótido que comprende los nucleótidos 400 a 609, o los nucleótidos 260 a 609, o los nucleótidos 200 a 609 de un polinucleótido que tiene la secuencia como la expuesta en la SEQ lD NO: 3;

d) un polinucleótido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con cualquiera de los polinucleótidos de a) hasta c) ;

e) un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas a cualquiera de los polinucleótidos de a) hasta c) ;

f) un polinucleótido que comprende un fragmento de al menos 50 nucleótidos consecutivos, o al menos 100 nucleótidos consecutivos, o al menos 200 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en SEQ ID NO: 1 o 3.

en donde el casete de expresión comprende además uno o más polinucleótidos transgénicos operativamente enlazados al polinucleótido del promotor.

5. La planta transgénica de la reivindicación 4, en donde dicho polinucleótido transgénico operativamente enlazado codifica un agente que interrumpe el metabolismo, el crecimiento, y/o la reproducción de un nemátodo que parasita una planta, que confiere o mejora la resistencia de la planta a un nemátodo que la parasita, o que es tóxico para un nemátodo que parasita la planta.

6. La planta transgénica de la reivindicación 4 o 5, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de maíz, trigo, cebada, sorgo, centeno, triticale, arroz, caña de azúcar, árboles cítricos, piña, coco, banana, café, té, tabaco, girasol, arvejas, alfalfa, soja, zanahoria, apio, tomate, patata, algodón, tabaco, berenjena, pimiento, colza

oleaginosa, canola, remolacha, repollo, coliflor, brócoli, lechuga, Lotus sp., Medicago truncatula, pastos perennes, ballico y Arabidopsis thaliana.

7. La planta transgénica de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de M. truncatula, M. sativa, G. max, P. sativum, A. hypogea, C. arietinum, V. faba, P. vulgaris, Lupinus albus, Lupinus luteus, Lupinus angustifolius y Lens culinaris.

8. La planta transgénica de la reivindicación 7, en donde la planta es Glycine max.

9. Un método para conferir o mejorar la resistencia a los nemátodos en una planta, que comprende: a) preparar un casete de expresión como se define en Ia reivindicación 3, b) transformar una célula de una planta con el casete de expresión de a) en donde el polinucleótido del promotor induce la transcripción del segundo polinucleótido operativamente enlazado en la célula de la planta en respuesta a un estimulo del nemátodo; c) regenerar la célula de la planta transformada para producir una planta transgénica y d) seleccionar una planta que tenga mayor resistencia a los nemátodos en comparación con una planta que tiene el mismo genotipo sin comprender el casete de expresión de a) .

10. Un método para conferir o mejorar la resistencia a los nemátodos en una planta, que comprende: a) preparar un casete de expresión como se reivindica en Ia reivindicación 3 que comprende un segundo polinucleótido que se encuentra en orientación antisentido respecto de un polinucleótido del promotor de la reivindicación 1, b) transformar una célula de una planta con la construcción de a) en donde el segundo polinucleótido interrumpe o reduce la expresión de la función reguladora del polinucleótido del promotor; y c) regenerar la célula de la planta transformada para producir una planta transgénica y d) seleccionar una planta que tenga mayor resistencia a los nemátodos en comparación con una planta que tiene el mismo genotipo sin comprender el casete de expresión de a) .

11. El método de la reivindicación 9 o 10 en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de maíz, trigo, cebada, sorgo, centeno, triticale, arroz, caña de azúcar, árboles cítricos, piña, coco, banana, café, té, tabaco, girasol, arvejas, alfalfa, soja, zanahoria, apio, tomate, patata, algodón, tabaco, berenjena, pimiento, colza oleaginosa, canola, remolacha, repollo, coliflor, brócoli, lechuga, Lotus sp., Medicago truncatula, pastos perennes, ballico y Arabidopsis thaliana.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de M. truncatula, M. sativa, G. max, P. sativum, A. hypogea, C. arietinum, V. faba, P. vulgaris, Lupinus albus, Lupinus luteus, Lupinus angustifolius y Lens culinaris.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde la planta es Glycine max.

Figura 1: Secuencia de la región promotora de A. thaliana del locus At1g21460 (pWT128) (SEQ ID NO: 1) . Una caja TATA se encuentra ubicada del par de bases 830 al par de bases 836 y está marcada en negrita.

Figura 3: Secuencia de la región promotora de Glycine max del gen correspondiente al clon 47116125 de ADNc contenido en pAW222qcz denominado p-47116125 (SEQ ID NO: 3) . Una caja TATA se encuentra ubicada en el par de bases 513 al par de bases 519 y está marcada en negrita.

Figura 4: Secuencia del clon 47116125 de ADNc de Glycine max. El codón de inicio del orf está en negrita en las base.

23. 25. El codón de detención del orf está en negrita e itálicas en las bases 785 - 787. El orf completo abarca las base.

23. 787.

Figura 5: Alineamiento de secuencia de las secuencias de aminoácidos del clon 47116125 de ADNc de Glycine max (SEQ ID NO: 5) , locus At1g21460 de A. thaliana (SEQ ID NO: 6) y locus At5g53190 de A. thaliana (SEQ ID NO: 7) .

Figura 6: Secuencia de la secuencia derivada del desplazamiento sobre el genoma de pAW127 (SEQ ID NO: 8) . El codón de inicio para la secuencia codificadora de 47116125 está marcado en negrita y se encuentra ubicado en 660 - 662 pb. Existe un codón de detención secuencia arriba de este codón de inicio en el mismo marco marcado en negrita e itálica que comienza en 627 pb. La secuencia del promotor clonada en pAW222qcz está representada de 51 a 659 pb.

Figura 7a:

Alineamiento de secuencia del clon 47116125 de ADNc de G. max (SEQ ID NO: 4) y secuencia de G. max derivada del desplazamiento sobre el genoma contenida en pAW127 (SEQ ID NO: 8) que dirige al clon 47116125 de ADNc. El codón de inicio ATG del clon 47116125 de ADNc de G. max (SEQ ID NO: 4) comienza en pb 660 de la secuencia pAW127. Un polinucleótido del promotor de 609 pb es descrito por la SEQ ID NO: 3 y se deriva de las bases 51 a 659 de la secuencia pAW127 (SEQ ID NO: 8) . La falta de coincidencias de las secuencias entre la secuencia pAW127 y la secuencia de ADNc de 47116125 está marcada con un asterisco.

Figura 7b

Figura 8: Patrones de expresión de j-glucuronidasa de los vectores binarios pAW222qcz y pWT128 en el ensayo de la raíz vellosa de soja expuesto en el Ejemplo 2. Las raíces vellosas infectadas por nemátodos de quiste de la soja y las raíces vellosas de control no infectadas se tiñeron 12 días después de la inoculación del SCN. Se utilizó el siguiente índice de puntuación: “-” para ausencia de coloración de GUS, “+”para coloración leve de GUS, “++” para coloración intensa de GUS.

Infectado por SCN:

SEQ ID Construcción Punta de raíz Vascular Cortical Sincitios

1 PWT128 - + - +

3 PAW222qcz - ++ - ++

Control no infectado:

SEQ ID Construcción Punta de raíz Vascular Cortical

1 PWT128 - + -

3 pAW222qcz - ++ -

Figura 9: Patrones de expresión de j-glucuronidasa de los vectores binarios pWT128, RTJ113 y RTJ114 en el ensayo de raíz vellosa de soja expuesto en el Ejemplo 4. Las raíces vellosas infectadas por nemátodos de quiste de la soja y las raíces vellosas de control no infectadas se tiñeron 12 días después de la inoculación del SCN. Se utilizó el siguiente índice de puntuación: “-” para ausencia de coloración de GUS, “+” para coloración leve de GUS, “++” para coloración intensa de GUS.

Infectado por SCN:

SEQ ID Construcción Punta de raíz Vascular Cortical Sincitios

1 PWT128 - + - +

1 RTJ113 - ++ - +

1 RTJ114 - ++ - +

Control no infectado:

SEQ ID Construcción Punta de raíz Vascular Cortical

1 PWT128 - + -

1 RTJ113 - ++ -

1 RTJ114 - ++ -

Figura 10: Patrones de expresión de j-glucuronidasa de los vectores binarios pAW222qcz, RTJ117 y RTJ118 en el ensayo de raíz vellosa de soja expuesto en el Ejemplo 4. Las raíces vellosas infectadas por nemátodos de quiste de la soja y las raíces vellosas de control no infectadas se tiñeron 12 días después de la inoculación del SCN. Se utilizó el siguiente índice de puntuación: “-” para ausencia de coloración de GUS, “+” para coloración leve de GUS, “++” para coloración intensa de GUS.

Infectado por SCN:

SEQ ID Construcción Punta de raíz Vascular Cortical Sincitios

3 PAW222qcz - ++ - ++

3 RTJ117 - ++ - ++

3 RTJ118 - + - ++

Control no infectado:

SEQ ID Construcción Punta de raíz Vascular Cortical

3 PAW222qcz - ++ -

3 RTJ117 - ++ -

3 RTJ118 - + -

Figura 12: Tabla que muestra las fórmulas generales de secuencia (fórmula 1 y fórmula 2) de los elementos de secuencia identificados en fragmentos mínimos del polinucleótido del promotor.

elemento de la secuencia fórmula general 1 para el elemento de la secuencia SEQ ID NO: fórmula general 2 para el elemento de la secuencia SEQ ID NO:

elemento 1 wndwmvnkmdagaan 25 wraaavttwdagaad 34

elemento 2 nnwmwhmwsttannnnn 26 rramwacwsttakmynh 35

elemento 3 wmwactdttdnnh 27 wmwactdttakwh 36

elemento 4 nbnntatawawhnnn 28 hydhtatawatabrs 37

elemento 5 hawhttawtnn 29 waawttawtmh 38

elemento 6 dnwrnnnttaadwdhdn 30 wnwrdtwttaawwdwwv 39

elemento 7 nnaamwnwnndnwnwnrrd 31 kraaatwakrr y wtwraak 40

elemento 8 nnnatdattan 32 ymratdattan 41

elemento 9 dwwdwhwaamwbwanwd 33 wattwwtaaawgwayaw 42

Símbolos de letras usados como abreviaturas para nucleótidos alternativos

símbolo alternativas de nucleótidos

a a (adenina)

g g (guanina)

c c (citosina)

t t (timina)

r g o a

y t o c

m a o c

k g o t

s g o c

w a o t

b g o c o t

d a o g o t

h a o c o t

v a o g o c

n a o g o c o t

Figura 13: Secuencia general para el fragmento mínimo del polinucleótido del promotor de la región promotora de A. thaliana del locus At1g21460 (pWT128) (SEQ ID NO: 43) y tabla que muestra 16 elementos de secuencia contenidos en la SEQ ID NO: 43.

elemento (No.) posición inicial (nucleótido) posición final (nucleótido) más cadena (+) o menos cadena (-)

elemento 5 3 13 +

elemento 6 1 17 -

elemento 6 22 38 +

elemento 5 32 42 +

elemento 6 30 46 -

elemento 6 37 53 -

elemento 7 41 59 -

elemento 5 60 70 +

elemento 3 68 80 +

elemento 9 67 83 -

elemento 5 75 85 -

elemento 8 86 96 -

elemento 4 132 146 +

elemento 2 155 171 +

elemento 1 173 187 -

Figura 14: Secuencia general para el fragmento mínimo del polinucleótido del promotor de la región promotora de A. thaliana del locus At5g53190 (SEQ ID NO: 44) y tabla que muestra 9 elementos de secuencia contenidos en la SEQ ID NO: 44.

elemento (No.) posición inicial (nucleótido) posición final (nucleótido) más cadena (+) o menos cadena (-)

elemento 1 1 15 -

elemento 1 62 76 +

elemento 8 162 172 +

elemento 6 168 184 +

elemento 9 170 186 +

elemento 1 180 194 +

elemento 2 191 207 +

elemento 3 193 205 +

elemento 4 197 211 +

Figura 15: Secuencia general para el fragmento mínimo del polinucleótido del promotor de la región promotora de Glycine max del gen correspondiente al clon 47116125 de ADNc (SEQ ID NO: 45) y tabla que muestra 7 elementos de secuencia contenidos en la SEQ ID NO: 45.

elemento (No.) posición inicial (nucleótido) posición final (nucleótido) más cadena (+) o menos cadena (-)

elemento 1 1 15 -

elemento 5 38 48 +

elemento 2 58 74 -

elemento 3 60 72 -

elemento 4 82 96 +

elemento 5 125 135 +

elemento 7 139 157 -