Nanoestructuras multifuncionales como agentes de diagnosis trimodal MRI-OI-SPECT.

Nanoestructuras multifuncionales que consisten en una ferritina, caracterizada porque comprende al menos un quantum dot y al menos una molécula de un polímero biocompatible ambos unidos covalentemente a la superficie de la ferritina. La invención también se refiere a un método para obtener dichas nanoestructuras, así como a su uso como medicamento y más preferiblemente para la diagnosis de cáncer o como agente de contraste.

Nanoestructuras multifuncionales como agentes de diagnosis trimodal MRI-OI-SPECT.

La presente invención se refiere a una nanoestructura multifuncional, concretamente a una ferritina, además de su aplicación como agente de contraste en OI, MRI o SPECT. Por tanto, la invención se podría encuadrar dentro del campo de la biomedicina.

Estado de la técnica

La integración de la Nanotecnología en la biotecnología ha hecho florecer una nueva disciplina: la nanomedicina. En este campo, se diseñan y preparan nanopartículas metálicas para obtener bioimágenes mediante el uso simultáneo de varias técnicas, distribución efectiva de fármacos o técnicas de terapias tan prometedoras como la hipertermia originada localmente por nanopartículas magnéticas. Es un área de tremendo potencial sujeta al desarrollo de nuevas nanoestructuras para su avance.

Las nanopartículas magnéticas han atraído atención principalmente por su uso potencial como agentes de contraste en Imagen por Resonancia Magnética (MRI). Esta técnica se basa en la resonancia magnética de los protones de tejidos del cuerpo (agua, membranas, lípidos, proteínas, etc) y es actualmente el método más potente de diagnosis.

El contraste en MRI, puede mejorarse con sustancias paramagnéticas. La capacidad de un compuesto para incrementar la velocidad de relajación de los espines de protón de las moléculas de agua del entorno se llama relajación y se define como R1∼1/T1 o R2∼1/T2. Las nanopartículas superparamagnéticas son candidatos para actuar como agentes de contraste en MRI. Al igual que las sustancias paramagnéticas, pierden su magnetización cuando se elimina el campo magnético externo, pero a diferencia de éstas, su magnetización es sensiblemente mayor. Por lo tanto, la relajación que producen es mucho más alta que las de los clásicos complejos paramagnéticos de Gd(III). El efecto de las nanopartículas superparamagnéticas se puede describir en base a la heterogeneidad del intenso campo magnético que afecta a los protones de alrededor, induciendo un desfase del momento magnético y dando lugar a un acortamiento del tiempo de relajación T2. De este modo, las nanopartículas superparamagnéticas son unos buenos candidatos para el desarrollo de nuevos agentes de contraste, permitiendo una detección temprana de patologías severas y de gran impacto social.

Por otro lado, los denominados quantum dots (QDs), han sido usados con éxito como nuevos marcadores fluorescentes en el campo biomédico y son considerados como una herramienta prometedora en Imagen óptica de fluorescencia (OI) para diagnóstico clínico. Los QDs son nanopartículas inorgánicas, generalmente compuestas de elementos de los grupos II-VI y III-V, los cuales, debido a su confinamiento cuántico de cargas en un diminuto espacio muestran unas propiedades fluorescentes únicas: espectros de emisión estrechos, rendimiento cuántico alto, espectros de absorción anchos, buena estabilidad química y alta fotoestabilidad y longitud de onda de emisión dependiente del tamaño, ampliando su rango de emisión hasta la región NIR (infrarrojo cercano) o IR (infrarrojo) y ofreciendo una mayor penetración en tejido para una mejor imagen. Sin embargo, a pesar de las excepcionales propiedades fluorescentes que presentan, estas nanopartículas necesitan ser funcionalizadas con algún tipo de polímero o proteína que las haga biocompatibles y por tanto aptas para su utilización in vivo.

Un enfoque dentro de la nanomedicina es el uso de nanopartículas que puedan combinar diferentes técnicas de bioimagen. Cada modalidad de bioimagen tiene sus propios méritos pero también ciertas desventajas y por lo tanto los métodos de imagen multimodales presentan mayor capacidad para obtener una imagen integral y más detallada. La combinación MRI-OI es un buen ejemplo de un método biomodal y una ruta para su consecución es el uso de nanoestructuras que contengan dos componentes metálicos, uno magnético y otro fluorescente: nanopartículas bifuncionales magneto-fluorescente. El nanocomponente magnético puede incorporar un radiomarcador, como ^99mTcO₄^-, añadiendo a la nanoestructura multifuncional una nueva modalidad de imagen médica mediante la detección de la radiación gamma que dicho radionúclido genera mediante gammagrafía (SPECT).

Un punto clave para la aplicación biomédica de las nanopartículas metálicas es que no pueden ser tóxicas y deben permanecer en circulación el tiempo suficiente para alcanzar el blanco biológico. El sistema fagocítico mononuclear (MPS) reconoce y elimina, a través de los macrófagos, las partículas de la circulación, con su simultánea concentración en órganos con alta actividad fagocítica (principalmente el hígado). Por lo tanto, una estrategia sensata es el uso de nanopartículas que sean capaces de evadir el ataque por parte del MPS y no sean fagocitadas por los macrófagos, aumentando consecuentemente el tiempo de vida media en plasma y permitiendo alcanzar un órgano o tejido específico.

Este tipo de agentes de diagnosis ideales para su aplicación clínica deberían poseer una alta y específica acumulación en las células adecuadas, lo que tendría como consecuencia la posibilidad de diagnosticar de forma cada vez más precoz una enfermedad aún tratable.

Numerosos métodos físicos y químicos han sido utilizados para preparar nanopartículas magnéticas. Puesto que las propiedades magnéticas son muy dependientes del tamaño, es crucial que el método a desarrollar permita la obtención de nanopartículas con tamaños uniformes. Una posible ruta para obtener nanopartículas metálicas sin agregación y con tamaño controlado es el uso de una plataforma molecular preorganizada, con una cavidad que pueda actuar como nanoreactor para el control químico y espacial en la formación de las nanopartículas. Un ejemplo típico de este tipo de moléculas es la proteína ferritina. La apoferritina consiste en una proteína esférica formada por 24 subunidades rodeando una cavidad acuosa con un diámetro de aproximadamente 8 nm.

La organización de las multisubunidades para formar la apoferritina genera la presencia de canales. Ocho canales hidrofílicos de aproximadamente 4 A permiten la entrada de iones metálicos y moléculas suficientemente pequeñas al interior de la cavidad de la proteína. Esto ha permitido la introducción de magnetita en el interior de la apoferritina produciendo magnetoferritina, la cual ha sido usada como método de diagnostico monomodal (MRI) (Journal of Magnetic Resonance Imaging. 4(3):497-505, 1994 May-Jun.).

Descripción detallada de la invención

En vista del estado de la técnica un objetivo de la presente invención es proporcionar un agente de contraste OI, el cual puede además ser usado como agente bimodal, OI-MRI, e incluso trimodal, OI-MRI-SPECT, basado en una ferritina, caracterizada porque comprende al menos un quantum dot (QD) y al menos una molécula de un polímero biocompatible unidos ambos covalentemente a la superficie de la ferritina (Figura 1). Estas partículas han demostrado que se biodistribuye en diferentes tejidos, como el hígado, pulmón y cerebro, por lo que son útiles como agentes de contraste para enfermedades en dichos tejidos.

La ferritina de la invención es biocompatible y la bioconjugación con un quantum dot, mejora significativamente la biodistribución de ambas partículas por separado. La nanoestructura formada por la conjugación de la ferritina y del quantum dot puede ser usada como agente de contraste en OI y muestra tiempos de vida medios suficientemente extensos para distribuirse por el sistema circulatorio sin ser fagocitados en un tiempo menor de 3 h, pero a la vez suficientemente cortos para evitar su acumulación en el cuerpo.

En el contexto de la presente invención se entiende por ferritina cualquier apo-ferritina, independiente del material que se encuentre encapsulado en su cavidad interna, incluidas las apo-ferritinas en las cuales la cavidad interna está vacía.

Los componentes fluorescentes, como por ejemplo los QD525, QD655 y QD800, que podría enlazar covalentemente a la capa externa de la ferritina mediante formación de un enlace covalente amida por reacción entre los grupos -NH₂ libres de los restos de lisinas de la capa externa de la ferritina y los grupos carboxílicos del QD.

Los denominados quantum dots QDs, han sido usados con éxito como nuevos marcadores fluorescentes en el campo biomédico y son considerados como una herramienta prometedora en Optical Imaging... [Seguir leyendo]

1. Una ferritina, caracterizada porque comprende al menos un quantum dot y al menos una molécula de un polímero biocompatible ambos unidos covalentemente a la superficie de la ferritina.

2. La ferritina según la reivindicación anterior, caracterizada porque el quantum dot emite entre 750 y 850 nm.

3. La ferritina según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el quantum dot está funcionalizado con grupos carboxílicos.

4. La ferritina según cualquiera las tres reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el quantum dot está unido covalentemente a la superficie de la ferritina mediante enlaces amida.

5. La ferritina según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende entre 1 y 2 unidades de quantum dots anclados a la superficie de la ferritina.

6. La ferritina según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el polímero biocompatible es polietilén glicol.

7. La ferritina según la reivindicación anterior, caracterizada porque es obtenible por la unión de PEG1163 MeO-PEG-COO-Su α-Metoxi-ω-ácido carboxílico succinimidil éster poli(etilenglicol) PEG-WM 2,000 Dalton a la superficie de la ferritina.

8. La ferritina según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el polietilén glicol está unido mediante enlaces covalentes de tipo amida.

9. La ferritina según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, caracterizada porque tiene entre 3 y 10 cadenas de polietilén glicol unidas covalentemente a la superficie de la ferritina.

10. La ferritina según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracteriza porque el núcleo tiene magnetita ocluyendo ^99mTc.

11. La ferritina según la reivindicación anterior, caracterizada porque la especie de ^99mTc es ^99mTcO₄^-.

12. La ferritina según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la concentración de la especie ^99mTc está comprendida entre 10^-9-10^-5M.

13. Un método para la síntesis de cualquiera de las ferritinas como se definen en las reivindicaciones anteriores que comprende:

a) anclar al menos un quantum dot a la superficie de la ferritina

b) y después anclar las cadenas de polietilén glicol a la superficie de la ferritina.

14. El método según la reivindicación anterior, donde la etapa (a) comprende: adicionar una disolución que comprende un quantum dot derivatizado con grupos carboxílicos en la superficie y una carboimida a otra disolución de la ferritina y posteriormente hacer reaccionar la disolución que comprende el polietilén glicol.

15. El método según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, donde la etapa (b) comprende un agente de acoplamiento.

16. El método según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el agente de acoplamiento se selecciona entre N,N-diciclohexilcarbodiimida, 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida, diisopropilcarbodiimida y cualquiera de sus combinaciones.

17. El método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 para la síntesis de cualquiera de las ferritinas como se definen en las reivindicaciones 10 a 12 que comprende antes de la incorporación del quantum dot al menos las siguientes etapas:

i) preparar una disolución de apoferritina, preferiblemente de concentración entre 0,1 y 100 mg/mL, y más preferiblemente entre 5 y 20 mg/mL,

ii) preparar una disolución que comprenda Fe (II) y Fe(III) en estequiometría aproximada de 1:2.

iii) preparar una disolución de pertenectato (^99mTc),

iv) adicionar de forma intercalada la disolución preparada en el paso (ii) y la disolución preparada en la etapa (iii) sobre la preparada en el paso (i).

v) aislar la magnetoferritina superparamagnética dopada con ^99mTc.

18. El método según la reivindicación anterior en la que la disolución de la etapa (ii) se prepara mezclando una disolución que comprende sulfato de hierro (II) amoniaco hexahidratado con otra que comprende Fe (NO₃)₃ en HCl.

19. El método según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, donde la disolución de la etapa (i) esta tamponada con AMPSO a un pH entre pH 7,5 y 9,5, preferiblemente entre 8,0 y 9,0.

20. Una composición farmacéutica que comprende la ferritina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

21. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación anterior para la preparación de un medicamento.

22. El uso de la composición según la reivindicación anterior para la preparación de un medicamento para la diagnosis de cáncer.

23. El uso de la ferritina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o de la composición farmacéutica según la reivindicación 20 para la preparación de un medicamento como agente de contraste.

24. El uso ferritina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o de la composición farmacéutica según la reivindicación 20 para la preparación de un medicamento para su uso como agente de contraste en MRI, OI o SPECT.