Formulaciones estabilizadas de factor IX que contienen trehalosa.

Una composición liofilizada que comprende factor IX y trehalosa,

en la que la trehalosa está presente en unacantidad del 0,5 al 3 % en volumen conservándose durante la liofilización y el almacenamiento durante 6 meses a 25ºC más del 90 % de la propiedad de unión al calcio del factor IX.

Formulaciones estabilizadas de factor IX que contienen trehalosa Solicitudes relacionadas La presente solicitud reclama prioridad sobre la solicitud provisional de EE.UU. Nº 61/016.230 presentada el 21 de diciembre de 2007.

Partes del acuerdo de investigación conjunto Este trabajo se produjo como resultado de un acuerdo de investigación entre Inspiration Biopharmaceuticals, Inc. e ICOS Corp.

Antecedentes de la invención Campo de la invención Las realizaciones de la invención se refieren a la estabilización de la estructura y de la actividad proteica durante la liofilización y el almacenamiento, en particular a la estabilización de los factores de coagulación sanguínea tales como el factor IX.

Descripción de la técnica relacionada El factor IX es una glucoproteína monocatenaria que participa en la vía de la coagulación. El factor IX es una molécula estructuralmente compleja que contiene un péptido señal en el extremo amino y una secuencia líder prepro (las cuales son escindidas antes de la secreción del factor a la circulación) , así como un dominio Gla responsable de la unión del Ca2+. El calcio desempeña un papel importante en la función del factor IX a través de su unión que provoca un cambio conformacional en la proteína necesario para la actividad de coagulación. La unión del calcio tiene como resultado la exposición de sitios de unión hidrofóbicos previamente enterrados que facilitan la unión a los fosfolípidos para una coagulación eficiente. El mantenimiento de la propiedad de la unión al calcio del factor IX es necesario para producir una proteína activa. Una vez que se ha escindido el péptido de activación, el factor IX monocatenario se convierte en el factor IXa activado por enzima, una glicoproteína bicatenaria unida a través de un puente disulfuro intercatenario. Adicionalmente, la molécula contiene muchos sitios de glucosilación unidos a N y a O. La deficiencia del factor IX tiene como resultado la hemofilia B, para la que actualmente se dispone de varios tratamientos, incluidos BeneFIX®, una versión recombinante del factor IX, y Mononine®, que deriva de plasma humano.

La formulación de Mononine® consiste en histidina, manitol, cloruro sódico y polisorbato 80. Estos son principalmente excipientes que se sabe que exhiben transiciones eutécticas (acontecimientos de cristalización) durante la congelación. No obstante, la formulación de Mononine® no contiene crioprotector ni estabilizante, solo agente tampón, agente espesante, tonificante y tensioactivo. En consecuencia, durante la congelación, la liofilización y el posterior almacenamiento, la proteína está relativamente sin proteger físicamente de los efectos desnaturalizantes debidos a la exposición al hielo, al agua y al aire. El problema técnico que se aborda en el presente documento es una formulación mejorada del factor IX con mejor estabilidad durante la congelación, la liofilización y el almacenamiento. Los presentes inventores han descubierto que la inclusión de trehalosa en la composición del factor IX durante la congelación, la liofilización y el almacenamiento estabilizaba la capacidad de unión al calcio del factor IX y mantenían la actividad biológica de la proteína purificada.

Sumario de la invención Las realizaciones de la invención están dirigidas a composiciones liofilizadas que incluyen factor IX y trehalosa, en las que la trehalosa está presente en una cantidad del 0, 5 al 3 % en volumen de modo que durante la liofilización y el almacenamiento durante 6 meses a 25 ºC, está presente más del 90 % de la propiedad de unión al calcio del factor IX.

Preferentemente, la trehalosa está presente en una cantidad del 1 al 2 % en volumen.

En algunas realizaciones preferidas, la composición incluye histidina como agente tampón. En algunas realizaciones preferidas, la composición incluye manitol. En algunas realizaciones preferidas, la composición incluye cloruro sódico. En algunas realizaciones preferidas, la composición incluye polisorbato 80.

En unas realizaciones más preferidas, las composiciones incluyen factor IX y trehalosa, y, adicionalmente, incluyen histidina a una concentración de 5 a 20 mM, manitol a una concentración de 2 a 5 % en volumen, cloruro sódico a una concentración de 50 a 80 mM y polisorbato 80 a una concentración del 0, 001 al 0, 005 % en volumen.

Las realizaciones de la invención están dirigidas a procedimientos para preparar una composición desecada estable de factor IX mezclando una solución que contiene factor IX con del 0, 5 al 3 % en volumen de trehalosa para obtener una solución crioprotectora y desecando por congelación la solución crioprotectora para obtener una composición

desecada estable de factor IX, en la que la composición desecada de factor IX conserva más del 90 % de la actividad de unión al calcio cuando se almacena durante 6 meses a 25 ºC.

Preferentemente, la trehalosa está presente en una cantidad del 1 al 2 % en volumen.

En algunas realizaciones preferidas, la solución incluye histidina como agente tampón. En algunas realizaciones preferidas, la solución incluye manitol. En algunas realizaciones preferidas, la solución incluye cloruro sódico. En algunas realizaciones preferidas, la solución incluye polisorbato 80.

En unas realizaciones más preferidas, la solución incluye factor IX y trehalosa, y, adicionalmente, incluye histidina a una concentración de 5 a 20 mM, manitol a una concentración del 2 al 5 % en volumen, cloruro sódico a una concentración de 50 a 80 mM, y polisorbato 80 a una concentración del 0, 001 al 0, 005 % en volumen.

Preferentemente, la desecación por congelación incluye una etapa de templado.

Las realizaciones de la invención están dirigidas a procedimientos de liofilizar una formulación farmacéutica que incluye factor IX y trehalosa mediante un procedimiento que incluye una o más de las etapas siguientes:

(a) congelar la formulación farmacéutica que contiene factor IX y de 0, 5 a 3 % en volumen de trehalosa a una temperatura de -40 ºC o menos;

(b) templar la formulación farmacéutica a entre aproximadamente -20 ºC y -35 ºC;

(c) disminuir la temperatura de la formulación farmacéutica a -40 ºC o menos;

(d) desecar la formulación farmacéutica en una primera etapa de desecación a 5 ºC a 20 ºC a presión reducida; y

(e) desecar la formulación farmacéutica en una segunda etapa de desecación a 45 ºC a 55 ºC a presión reducida.

Preferentemente, la formulación farmacéutica también incluye histidina a una concentración de 5 a 20 mM, manitol a una concentración del 2 al 5 % en volumen, cloruro sódico a una concentración de 50 a 80 mM, y polisorbato 80 a una concentración del 0, 001 al 0, 005 % en volumen.

Otros aspectos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas.

Breve descripción de las figuras

A continuación se describirán estas y otras características de de la presente invención con referencia a las figuras de realizaciones preferidas.

La Figura 1 muestra la estabilidad del factor IX a 40 ºC/HR del 75 %. "■" indica 0, 4 mg/ml de la proteína factor IX en histidina 10 mM, 3 % de manitol, NaCl 66 mM, 0, 0075 % de polisorbato 80, pH 6, 8 (R1) . "•" indica 0, 4 mg/ml de la proteína factor IX en histidina 10 mM, 3 % de manitol, NaCl 66 mM, 0, 0075 % de polisorbato 80, pH 6, 8 con 1 % de trehalosa (R2) .

La Figura 2 muestra el perfil de elución SE-HPLC de las composiciones de factor IX después de almacenar durante 12 semanas. La Figura 2A muestra 0, 4 mg/ml de la proteína factor IX en histidina 10 mM, 3 % de manitol, NaCl 66 mM y 0, 0075 % de polisorbato 80, pH 6, 8 (R1) . La Figura 2B muestra 0, 4 mg/ml de la proteína factor IX en histidina 10 mM, 3 % de manitol, NaCl 66 mM, 0, 0075 % de polisorbato 80, pH 6, 8 con 1 % de trehalosa (R2) .

La Figura 3 muestra el perfil de elución SE-HPLC (calcio) del factor IX después de almacenar durante 12 semanas. La Figura 3A muestra 0, 4 mg/ml de la proteína factor IX en histidina 10 mM, 3 % de manitol, NaCl 66 mM y 0, 0075 % de polisorbato 80, pH 6, 8 (R1) . La Figura 3B muestra 0, 4 mg/ml de la proteína factor IX en histidina 10 mM, 3 % de manitol, NaCl 66 mM, 0, 0075 % de polisorbato 80, pH 6, 8 con 1 % de trehalosa (R2) .

La Figura 4 muestra la estabilidad de la unión al calcio del factor IX a 40 ºC/HR del 75 %. "■" indica 0, 4 mg/ml de la proteína factor IX en histidina 10 mM, 3 % de manitol, NaCl 66 mM, 0, 0075 % de polisorbato 80, pH 6, 8 (R1) . "•" indica 0, 4 mg/ml de la proteína factor IX en histidina 10... [Seguir leyendo]

1. Una composición liofilizada que comprende factor IX y trehalosa, en la que la trehalosa está presente en una cantidad del 0, 5 al 3 % en volumen conservándose durante la liofilización y el almacenamiento durante 6 meses a 25 ºC más del 90 % de la propiedad de unión al calcio del factor IX.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que la trehalosa está presente en una cantidad del 1 al 2 % en volumen.

3. La composición de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, que además comprende histidina como agente tampón.

4. La composición de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, que comprende además manitol, cloruro sódico o polisorbato 80.

5. La composición de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, que comprende además histidina a una concentración de 5 a 20 mM, manitol a una concentración del 2 al 5 % en volumen, cloruro sódico a una concentración de 50 a 80 mM y polisorbato 80 a una concentración del 0, 001 al 0, 005 % en volumen.

6. Un procedimiento para preparar una composición desecada estable del factor IX, que comprende:

mezclar una solución que comprende factor IX con del 0, 5 al 3 % de trehalosa en volumen para obtener una solución crioprotectora; y desecar por congelación la solución crioprotectora para obtener una composición desecada estable de factor IX, en el que la composición desecada del factor IX conserva más del 90 % de la actividad de unión al calcio cuando se almacena durante 6 meses a 25 ºC

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la trehalosa está presente en una cantidad del 1 al 2 % en volumen.

8. El procedimiento de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7, en el que la solución comprende además histidina, manitol, cloruro sódico o polisorbato 80.

9. El procedimiento de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7, en el que la solución comprende además histidina a una concentración de 5 a 20 mM, manitol a una concentración del 2 al 5 % en volumen, cloruro sódico a una concentración de 50 a 80 mM y polisorbato 80 a una concentración del 0, 001 al 0, 005 % en volumen.

10. El procedimiento de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7, en el que la desecación por congelación comprende una única etapa de templado.

11. Un procedimiento de liofilización de una formulación farmacéutica que comprende factor IX y trehalosa, que comprende las etapas de:

(a) congelar la formulación farmacéutica que comprende factor IX y del 0, 5 al 3 % en volumen de trehalosa a una temperatura de -40 ºC o menos;

(b) templar la formulación farmacéutica a entre aproximadamente -20 ºC y -35 ºC;

(c) disminuir la temperatura de la formulación farmacéutica a -40 ºC o menos;

(d) desecar la formulación farmacéutica en una primera etapa de desecación a 5 ºC a 20 ºC a presión reducida; y

(e) desecar la formulación farmacéutica en una segunda etapa de desecación a 45 ºC a 55 ºC a presión reducida.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la formulación farmacéutica comprende además histidina a una concentración de 5 a 20 mM, manitol a una concentración del 2 al 5 % en volumen, cloruro sódico a una concentración de 50 a 80 mM y polisorbato 80 a una concentración del 0, 001 al 0, 005 % en volumen.