MARCO DE LECTURA ABIERTO RV2660C DE M. TUBERCULOSIS Y SU UTILIZACIÓN.

Composición inmunógena, que comprende un polipéptido sustancialmente puro codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende el marco de lectura abierto Rv2660c de M.

tuberculosis: o un polipéptido codificado por un fragmento de nucleótidos de por lo menos 25 nucleótidos contiguos del marco de lectura abierto Rv2660c de M. tuberculosis; o dicho polipéptido fusionado a otras proteínas o partes de las mismas; y un excipiente farmacéuticamente aceptable

La tuberculosis es una lacra humana antigua que sigue siendo un importante problema de salud pública en todo el mundo. Es una epidemia en curso de proporciones asombrosas. Aproximadamente una de cada tres personas en el mundo está infectada con Mycobacterium tuberculosis, y tiene un riesgo de por vida del 10% de avance de la infección a la enfermedad clínica. Aunque la tuberculosis se puede tratar, se estima que 2,9 millones de personas murieron a causa de la enfermedad el año pasado.

Hay problemas significativos con la dependencia en el tratamiento farmacológico para controlar las infecciones activas de M. tuberculosis. La mayoría de las regiones con altos índices de infección son los países menos desarrollados, que sufren de una falta de servicios de salud accesibles fácilmente, servicios de diagnóstico y los antibióticos adecuados frente a M. tuberculosis. Incluso cuando estos están disponibles, el cumplimiento por parte del paciente suele ser deficiente debido al largo régimen necesario para el tratamiento completo, y las cepas resistentes a múltiples fármacos son cada vez más comunes.

La prevención de la infección eludiría los problemas de tratamiento, por lo que la vacunación contra la tuberculosis se realiza extensamente en las regiones endémicas. Alrededor de 100 millones de personas al año son vacunadas con bacilo de Calmette-Guerin (BCG) vivo. El BCG tiene la gran ventaja de ser barato y puede administrarse con facilidad bajo circunstancias menos que óptimas, con pocas reacciones adversas. Desafortunadamente, la vacuna es muy variable en su eficacia, proporcionando en cualquier lugar de un 0 a un 80% de protección contra la infección con M. tuberculosis.

El BCG tiene una historia interesante. Se trata de una cepa atenuada de M. bovis, un pariente muy cercano del

M. tuberculosis. La cepa de M. bovis que se convirtió en BCG fue aislada de una vaca en la década de 1800 por parte de un bacteriólogo llamado Nocard, por lo que fue llamado bacilo de Nocard. La atenuación del bacilo Nocard tuvo lugar desde 1908 hasta 1921, a lo largo de 230 pasos in vitro. A partir de entonces, se cultiva ampliamente en todo el mundo, resultando en cientos adicionales y a veces miles de pasos in vitro. A lo largo de sus muchos años en el laboratorio, ha habido la selección de la reacción cruzada con la prueba cutánea de la tuberculina, y para disminuir los efectos secundarios. El resultado neto ha sido un agente patógeno debilitado considerablemente, lo que puede ser ineficaz en la producción de una respuesta inmunológica adecuada.

Nuevas vacunas contra la tuberculosis se necesitan con urgencia para la población general en las regiones endémicas, para las personas infectadas por el VIH, así como profesionales de la salud que puedan estar expuestos al bacilo de la tuberculosis. Se han desarrollando vacunas de ADN recombinante que llevan genes protectores de M. tuberculosis virulenta usando fásmidos de transporte para transferir material genético de una especie micobacteriana a otra, por ejemplo, ver la patente US 5.776.465. Al desarrollo de la vacuna de la tuberculosis se le debe dar una alta prioridad en los actuales objetivos de la investigación médica.

Literatura relevante

Mahairas et al. (1995) J Bacteriol 178 (5): 1274-1282 proporciona un análisis molecular de las diferencias genéticas entre BCG de Mycobacterium bovis y M. bovis virulenta. La hibridación genómica sustractiva fue utilizada para identificar las diferencias genéticas entre M. bovis virulenta y M. tuberculosis y BCG no virulenta, la patente US

5.700.683 se dirige a estas diferencias genéticas.

Cole et al. (1998) Nature 393: 537-544 han descrito el genoma completo de M. tuberculosis. Para obtener la secuencia contigua del genoma, se utilizó un enfoque combinado que implicó el análisis de secuencia sistemática de clones seleccionados de gran inserción, así como clones aleatorios de pequeña inserción de una librería de disparo del genoma completo. Esto culminó en una secuencia compuesta de 4.411.529 pares de bases, con un contenido de G + C del 65,6%. 3.924 marcos de lectura abierta se identificaron en el genoma, lo que representa ~91% de la capacidad potencial de codificación.

La secuencia genómica de Mycobacterium tuberculosis (M.tb.) está disponible en varios sitios de Internet, incluyendo http://www.cric.com/htdocs/tuberculosis/index.html y http://www.sanger.ac.uk/pathogen.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una composición de inmunógenos que comprende un polipéptido codificado por como mínimo 25 nucleótidos del marco de lectura abierto Rv2660c, una micobacteria alterada genéticamente que comprende dicho marco de lectura abierto y métodos para la utilización de los productos de dicho marco de lectura abierto.

Se proporcionan marcadores genéticos que distinguen entre las cepas del Mycobacterium tuberculosis complejo, en particular entre cepas no virulentas y virulentas. Las cepas de interés incluyen M.bovis, cepas de BCG de M.bovis,

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M.tuberculosis (M.tb.) aislado, y bacteriófagos que infectan las micobacterias. Los marcadores genéticos se utilizan para los ensayos, por ejemplo, inmunoensayos, que distinguen entre las cepas, tal como para diferenciar entre la inmunización de BCG y la infección M.tb. Los productos de proteína pueden producirse y utilizarse como inmunógenos, en el cribado de fármacos, etc. Los marcadores son útiles en la construcción modificada genéticamente de células M.tb.

o M.bovis que tienen características mejoradas de la vacuna.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES

Se identifican supresiones genéticas específicas, y específicamente Rv2654c, que sirven como marcadores para distinguir entre cepas de micobacterias no virulentas y virulentas, incluyendo cepas de M.bovis, BCG de M.bovis, M.tuberculosis (M.tb) aislado y bacteriófagos que infectan las micobacterias. Esta supresión se utiliza como marcador genético para distinguir entre las micobacterias diferentes. La supresión puede introducirse en M.tb. o M.bovis mediante procedimientos recombinantes con el fin de producir una cepa patógena no virulenta. Por otra parte, el gen suprimido se identifica en la secuencia del genoma M.tb., y luego de nuevo mediante procedimientos recombinantes en BCG u otras cepas de vacuna, para mejorar la eficacia de la vacunación.

La supresión de la invención se identifica mediante hibridaciones de ADN comparativo de secuencias genómicas de micobacterias a una micromatriz de ADN que comprende las secuencias representativas de las secuencias codificadoras de M.tb.. Las supresiones se asignan entonces a la secuencia del genoma M.tb. conocida para identificar específicamente el gen o genes suprimidos, y para caracterizar la secuencia de nucleótidos de la región suprimida.

Los ácidos nucleicos que comprenden la supresión y las uniones proporcionadas se utilizan en una variedad de aplicaciones. Se pueden obtener sondas de hibridación a partir de la secuencia M. tb. conocida que se corresponde a las secuencias suprimidas. Estas sondas son útiles para distinguir entre las micobacterias. Por ejemplo, hay una probabilidad del 10% de que una persona infectada con M. tb. progrese a una enfermedad clínica, pero esa probabilidad puede variar dependiendo de la cepa infectante particular. Se utiliza un análisis para detectar la presencia o la ausencia de las supresiones previstas a continuación como "M. tb viable" para distinguir entre diferentes cepas de M. tb. Las supresiones son también útiles para identificar si un paciente que es positivo para la prueba cutánea de la tuberculina ha sido infectado con M. tb o con BCG.

En otra realización, las micobacterias son alteradas genéticamente para suprimir las secuencias identificadas aquí como ausentes en las cepas atenuadas, pero presentes en las cepas patógenas, por ejemplo, supresiones en BCG, pero presentes en H37Rv de M. tb. Estas cepas modificadas genéticamente pueden proporcionar vacunas superiores a los actuales presentes aislamientos de BCG en uso. Alternativamente, las cepas de BCG puede ser "reconstruidas" para parecerse más a M. tb de tipo salvaje mediante la inserción de nuevo de algunas de las secuencias suprimidas en el genoma. Como los productos de proteína de las secuencias suprimidas se expresan en especies de micobacterias virulentas, las... [Seguir leyendo]

1. Composición inmunógena, que comprende un polipéptido sustancialmente puro codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende el marco de lectura abierto Rv2660c de M. tuberculosis:

o un polipéptido codificado por un fragmento de nucleótidos de por lo menos 25 nucleótidos contiguos del marco de lectura abierto Rv2660c de M. tuberculosis;

o dicho polipéptido fusionado a otras proteínas o partes de las mismas; y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

2. Composición inmunógena según la reivindicación 1, que comprende además un adyuvante.

3. Composición inmunógena según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido está formulado conjuntamente con una micobacteria del complejo de M. tuberculosis.

4. Composición inmunógena según la reivindicación 3, en la que dicha micobacteria del complejo de M. tuberculosis es bacilo Calmette-Guerin o M. bovis.

5. Composición inmunógena según la reivindicación 1, para utilizar en un método de inmunización de un individuo a M. tuberculosis.

6. Micobacteria alterada genéticamente del complejo de M. tuberculosis, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos exógena que comprende el marco de lectura abierto Rv2660c de M. tuberculosis o por lo menos 25 nucleótidos contiguos del marco de lectura abierto Rv2660c de M. tuberculosis.

7. Micobacteria alterada genéticamente según la reivindicación 6, en la que dicho ácido nucleico exógeno codifica un polipéptido que se fusiona a otro péptido o proteína.

8. Micobacteria alterada genéticamente según la reivindicación 6, en la que dicha micobacteria es BCG.

9. Micobacteria según la reivindicación 6, y un portador fisiológicamente aceptable para la inyección.

10. Método para determinar si un paciente se ha expuesto a un miembro del complejo de la tuberculosis, comprendiendo el método:

poner en contacto una muestra del paciente con un polipéptido codificado por por lo menos 25 nucleótidos del marco de lectura abierto Rv2660c de M. tuberculosis, cuyo polipéptido no presenta reactividad cruzada para la exposición a BCG;

y determinar la presencia de una reacción inmune a dicho polipéptido, donde una respuesta positiva es indicativa de exposición al complejo de tuberculosis.

11. Método según la reivindicación 10, en el que el miembro del complejo de tuberculosis es Mycobacterium tuberculosis o Mycobacterium bovis.

12. Método según la reivindicación 10, en el que dicha muestra comprende una muestra de sangre o un derivado de la misma.

13. Método según la reivindicación 10, en el que dicha etapa de determinación comprende: detectar la unión de un anticuerpo a dicho polipéptido, siendo dicha unión una indicación de que dicho sujeto está infectado por Mycobacterium tuberculosis o ha enfermado con Mycobacterium tuberculosis.

14. Polipéptido codificado por el marco de lectura abierto Rv2660c de M. tuberculosis para su uso en un método de diagnóstico in vivo.

15. Polipéptido tal como se define en la reivindicación 14 para su uso en el diagnóstico de la tuberculosis causada por un miembro del complejo de tuberculosis.