PROCEDIMIENTOS Y MATERIALES PARA DETECTAR MATERIAL GENETICO.
Un dispositivo para almacenamiento y análisis de un resto que contiene ácido nucleico en una muestra biológica,
dispositivo que comprende una pluralidad de capas que comprende:
(a) una capa filtrante que comprende un medio sólido seco que comprende una matriz hidrófila sólida, y
(e) una capa de aislamiento que comprende un medio sólido seco que comprende una matriz neutra seca que tiene adsorbida a ella una composición que comprende SDS
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US02/36978.
Solicitante: WHATMAN, INC.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 200 WELLS AVENUE,NEWTON, MA 02459-3304.
Inventor/es: BURGOYNE,LEIGH A.,FINDERS TECHNOLOGIES PTY. LTD. MARK OLIPHANT BUILDING.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 23 de Diciembre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/10A3
Clasificación PCT:
- A61F13/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61F FILTROS IMPLANTABLES EN LOS VASOS SANGUINEOS; PROTESIS; DISPOSITIVOS QUE MANTIENEN LA LUZ O QUE EVITAN EL COLAPSO DE ESTRUCTURAS TUBULARES, p. ej. STENTS; DISPOSITIVOS DE ORTOPEDIA, CURA O PARA LA CONTRACEPCION; FOMENTACION; TRATAMIENTO O PROTECCION DE OJOS Y OIDOS; VENDAJES, APOSITOS O COMPRESAS ABSORBENTES; BOTIQUINES DE PRIMEROS AUXILIOS (prótesis dentales A61C). › Vendas o apósitos (suspensorios A61F 5/40; apósitos radiactivos A61M 36/14 ); Compresas absorbentes (aspectos químicos de las vendas, apósitos o compresas absorbentes* A61L 15/00, A61L 26/00).
- A61K9/14 A61 […] › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 9/00 Preparaciones medicinales caracterizadas por un aspecto particular. › en estado especial, p. ej. polvos (microcápsulas A61K 9/50).
- A61K9/20 A61K 9/00 […] › Píldoras, pastillas o comprimidos.
- C07H21/04 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con desoxirribosilo como radical sacárido.
- C12Q1/68 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Clasificación antigua:
- A61F13/00 A61F […] › Vendas o apósitos (suspensorios A61F 5/40; apósitos radiactivos A61M 36/14 ); Compresas absorbentes (aspectos químicos de las vendas, apósitos o compresas absorbentes* A61L 15/00, A61L 26/00).
- A61K9/14 A61K 9/00 […] › en estado especial, p. ej. polvos (microcápsulas A61K 9/50).
- A61K9/20 A61K 9/00 […] › Píldoras, pastillas o comprimidos.
- C07H21/04 C07H 21/00 […] › con desoxirribosilo como radical sacárido.
- C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Fragmento de la descripción:
Procedimientos y materiales para detectar material genético.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la detección de material biológico y, específicamente, a un dispositivo, un procedimiento y un kit para detectar un virus en fluidos biológicos.
Antecedentes de la invención
Habitualmente, la exploración de viriones se realiza por diversos procedimientos y con diversos materiales. Un procedimiento es la reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa ("RCP-TI") basada en la exploración de viriones, utilizando cebadores muy específicos. Pero el uso de cebadores muy específicos tiene inconvenientes. Por ejemplo, se pueden encontrar sólo ciertas especies de viriones y ocasionalmente no se encuentran variantes de secuencias extremas de esas especies.
El procedimiento convencional típico para la detección viral es la transcripción inversa de ARN con un cebador de TI en la proximidad de la secuencia a amplificar, seguida de la amplificación por RCP con un conjunto muy específico de cebadores y condiciones, de manera que se realiza una amplificación muy específica de una sección del genoma seleccionado. Alternativamente, para la TI-RCP se usan secuencias de cebadores al azar, pero con frecuencia éstos tienen unas eficiencias de amplificación muy bajas, y los cebadores no usados pueden interferir con el análisis por procedimientos de chips de ADN.
El primer procedimiento descrito antes para exploración de viriones basada en TI-RCP se basa en el uso de cebadores muy específicos a fines de amplificación. Los cebadores muy específicos tienen el inconveniente de (a) encontrar sólo una especie de virión y (b) ocasionalmente no encontrar variantes de secuencias extremas de esas especies. El segundo procedimiento, usando amplificación por TI-PCR no específica con cebadores al azar, no tiene ningunos de estos problemas, pero es impracticable para una amplificación grande y específica.
En la exploración de viriones se usan numerosos materiales. Para la preparación de material genético se han usado materiales revestidos de FTAMC desarrollados por la Flinders University en Australia. Los materiales y las técnicas de FTAMC dan material genético altamente purificado unido al filtro de base celulósica mientras duran las reacciones de amplificación y otras aplicaciones posteriores. Los materiales de filtración revestidos de FTAMC incluyen, no limitativamente, los papeles de filtro, BFC-180 Whatman celulósico, 31-ET, microfibra de vidrio y cualesquier otros materiales filtrantes conocidos por los expertos en la técnica.
El material genético se puede purificar del material revestido de FTAMC y luego eluir del material usando una combinación de agua y temperaturas elevadas. El material genético liberado es un fragmento soluble de longitud variable que es adecuado para muchos usos para cualesquier formas de metodologías de amplificación y detección. La elución del material genético es importante en aplicaciones que no serían posibles si el material genético quedara unido al material revestido de FTAMC. Como se ha mencionado previamente, el revestimiento de FTAMC se puede incluir en o dentro de otros materiales filtrantes de membrana, incluidos adicionalmente, no limitativamente, GF/F, GFB, QMB, Anopore, alúmina, GF/M, impregnados magnéticamente, polímeros soplados en estado fundido y polímeros modificados en la superficie. Estas membranas de filtración pueden dar una capacidad de unión superior, facilidad de elución y un almacenamiento prolongado del material genético.
Actualmente hay una gran necesidad de procedimientos muy sensibles y de amplia especifidad para la detección de rastros de ácidos nucleicos de patógenos tales como VIH o hepatitis en sangre y otras muestras biológicas. Esencialmente se requieren procedimientos para detectar y tipificar casi cualquier virión en fluidos del cuerpo, como puede ser por detección de ADN o ARN.
Sumario de la invención
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un dispositivo, un procedimiento y un kit para almacenamiento y análisis de un resto que contiene ácido nucleico en una muestra biológica. Específicamente, la presente invención se centra en la identificación de viriones conocidos o desconocidos contenidos en un fluido.
En un aspecto, la invención proporciona un dispositivo para almacenamiento y análisis de un resto que contiene ácido nucleico en una muestra biológica según se define en la reivindicación 1.
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para almacenamiento y análisis de un resto que contiene ácido nucleico en una muestra biológica según se define en la reivindicación 3 o la reivindicación 4.
En otro aspecto, la invención proporciona un dispositivo para almacenamiento y análisis de un resto que contiene ácido nucleico en una muestra biológica según se define en la reivindicación 2.
En otro aspecto, la invención proporciona un kit para almacenamiento y análisis de un resto que contiene ácido nucleico en una muestra biológica, kit que comprende:
En otro aspecto, la presente invención proporciona un kit para almacenamiento y análisis de un resto que contiene ácido nucleico en una muestra biológica, kit que comprende:
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Secuencias de ácido nucleico en suero humano contaminado con virus de la hepatitis C como dianas de la amplificación. Esta figura muestra carriles de amplificaciones de una amplificación por TI-RCP del tipo descrito en el Ejemplo 1, usando una transcripción inversa y varias condiciones de RCP de baja especifidad con una RPC de gama larga. En este ejemplo, todos los cebadores son de genoma de hepatitis C (un virión de ARN) y el suero almacenado en un papel de FTAMC está contaminado con hepatitis C.
Figura 2. Secuencias de ácido nucleico en suero humano contaminado con virus de Coxsackie como dianas de amplificación para secuencias de cebador no afines. La figura muestra una amplia gama de productos de peso molecular formados en algunos carriles, que aparecen como manchas longitudinales o configuraciones bandeadas debajo de los carriles. Algunas series de cebadores no generaron bandas, mientras que otras dieron las deseadas manchas bandeadas, confirmando que se había amplificado una muestra muy amplia del genoma de virus no homólogo.
Descripción de la invención
La presente invención proporciona en general un dispositivo accionable y que se puede automatizar para exploraciones en grandes series y el descubrimiento de variantes de secuencias de viriones conocidos, viriones no conocidos previamente y otros restos que contienen material genético. La presente invención proporciona además un procedimiento y un kit. Si bien se describen en esta memoria realizaciones específicas, éstas no son exhaustivas y se pueden incluir otros diseños adecuados que se pueden usar con sangre entera,...
Reivindicaciones:
1. Un dispositivo para almacenamiento y análisis de un resto que contiene ácido nucleico en una muestra biológica, dispositivo que comprende una pluralidad de capas que comprende:
2. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende una capa colectora que comprende un medio sólido seco que comprende una matriz porosa neutra y un agente anticoagulante o licuante seco que comprende tiol; y en el que la matriz sólida de la capa filtrante tiene un tamaño de partícula límite tal que excluye células eucarióticas pero no células procarióticas o viriones.
3. Un procedimiento para almacenamiento y análisis de un resto que contiene ácido nucleico en una muestra biológica usando un dispositivo según lo definido en la reivindicación 1, que comprende:
4. Un procedimiento para almacenamiento y análisis de un resto que contiene ácido nucleico en una muestra biológica usando un dispositivo según lo definido en la reivindicación 2, que comprende:
5. Un kit para almacenamiento y análisis de un resto que contiene ácido nucleico en una muestra biológica, kit que comprende:
6. El dispositivo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que además comprende:
7. El procedimiento de la reivindicación 3, que además comprende una etapa de protección entre la etapa de secado de la capa de aislamiento y la etapa de proporcionar el cebador, en el que la etapa de protección comprende poner una cobertura sobre al menos una parte del dispositivo, comprendiendo la cobertura:
8. El dispositivo de la reivindicación 6 o el procedimiento de la reivindicación 7, en el que el agente desnaturalizante general comprende SDS.
9. El dispositivo de la reivindicación 6 o el procedimiento de la reivindicación 7, en el que el agente desnaturalizante general comprende:
10. El dispositivo o procedimiento de la reivindicación 9, en el que el detergente comprende SDS.
11. El dispositivo de la reivindicación 1 o 2, en el que la capa filtrante comprende además un agente anticoagulante o licuante que comprende tiol.
12. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la capa filtrante de la etapa (a) además comprende un agente anticoagulante o licuante que comprende tiol.
13. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la capa filtrante de la etapa (b) además comprende un agente anticoagulante o licuante que comprende tiol.
14. El dispositivo de la reivindicación 11 o el procedimiento de la reivindicación 12 o 13, en el que el anticoagulante comprende EDTA o Tris-EDTA.
15. El dispositivo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o el procedimiento de la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en el que las composición de la capa aislante comprende además:
16. El dispositivo de la reivindicación 9 o 15, o el procedimiento de la reivindicación 9 o 15, en el que la base débil comprende Tris.
17. El dispositivo de la reivindicación 9 o 15, o el procedimiento de la reivindicación 9 o 15, en el que el agente quelante comprende EDTA.
18. El dispositivo de la reivindicación 1 o 2, o el procedimiento de la reivindicación 3 o 4, en el que la capa de aislamiento comprende además un cebador.
19. El dispositivo de la reivindicación 2, que además comprende:
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