Análisis secuencial de muestras biológicas con blanqueo intermedio de detector de fluorescencia.

Un procedimiento de sondar múltiples dianas en una muestra biológica,

que comprende:

(a) proporcionar una muestra que contiene múltiples dianas;

(b) unir al menos una sonda, que comprende un aglutinante acoplado a una enzima, a una o más dianas presentes en la muestra;

(c) hacer reaccionar la sonda unida con un sustrato enzimático acoplado a un generador de señal fluorescente;

(d) observar una señal procedente del generador de señal fluorescente de la etapa (c);

(e) aplicar a la muestra en la etapa (c) una solución, que comprende un agente oxidante que inactiva sustancialmente tanto al generador de señal fluorescente, como a la enzima;

(f) unir al menos una sonda, que comprende un aglutinante acoplado a una enzima, a una o más dianas presentes en la muestra de la etapa (e);

(g) hacer reaccionar la sonda unida con un sustrato enzimático acoplado a un generador de señal fluorescente; (h) observar una señal procedente del generador de señal fluorescente de la etapa (g).

Análisis secuencial de muestras biológicas con blanqueo intermedio de detector de fluorescencia Antecedentes En el presente documento se divulgan procedimientos para analizar secuencialmente una muestra biológica para discernir, entre otros, la presencia, ausencia, concentración y/o distribución espacial de múltiples dianas biológicas en una muestra biológica.

Se han usado varios procedimientos en biología y en medicina para observar dianas diferentes en una muestra biológica. Por ejemplo, se puede realizar análisis de proteínas en secciones histológicas y otras preparaciones citológicas usando las técnicas de histoquímica, inmunohistoquímica (IHC) o inmunofluorescencia. El análisis de proteínas en muestras biológicas también se puede realizar usando inmunoensayos en estado sólido usando, por ejemplo, las técnicas de transferencias de tipo western.

Muchas de las técnicas actuales pueden detectar únicamente unas pocas dianas a la vez (tal como, IHC o transferencias de tipo western basadas en fluorescencia, en las que el número de dianas detectables está limitado por el sistema de detección basado en fluorescencia) en una única muestra. Análisis adicionales de dianas pueden requerir el uso de muestras biológicas adicionales de la fuente, lo que limita la capacidad para determinar las características relativas de las dianas, tales como la presencia, ausencia, concentración y/o distribución espacial de múltiples dianas biológicas en la muestra biológica. Además, en ciertos casos, se dispone de una cantidad limitada de la muestra para el análisis o la muestra individual puede requerir más análisis. Por tanto se necesitan procedimientos, agentes y dispositivos capaces de analizar repetidamente una muestra individual.

Breve descripción En algunas realizaciones, se proporcionan procedimientos de sondeo de múltiples dianas en una muestra biológica. Los procedimientos incluyen las etapas de proporcionar una muestra que contiene múltiples dianas, unir al menos una sonda, que tiene un aglutinante acoplado a una enzima, a una o más dianas presentes en la muestra, y reaccionar la sonda unida con un sustrato enzimático acoplado a un generador de señal fluorescente. Los procedimientos incluyen las etapas de observar una señal procedente del generador de señal fluorescente y aplicar a la muestra una solución, que contiene un agente oxidante que inactiva sustancialmente tanto al generador de señal fluorescente, como a la enzima. Los procedimientos incluyen además las etapas de unir al menos una sonda, que tiene un aglutinante acoplado a una enzima, a una o más dianas presentes en la muestra de la etapa, reaccionar la sonda unida con un sustrato enzimático acoplado a un generador de señal fluorescente; y observar una señal procedente del generador de señal fluorescente. El procedimiento de unir, observar y oxidar se puede repetir de forma iterativa.

En algunas realizaciones, los procedimientos incluyen las etapas de proporcionar una muestra que contiene múltiples dianas, unir al menos una sonda, que tiene un aglutinante acoplado a una peroxidasa, a una o más dianas presentes en la muestra, y reaccionar la sonda unida con un sustrato de peroxidasa acoplado a un generador de señal fluorescente. Los procedimientos incluyen las etapas de observar una señal procedente del generador de señal fluorescente y aplicar a la muestra una solución, que contiene un agente oxidante que inactiva sustancialmente tanto al generador de señal fluorescente, como a la peroxidasa. Los procedimientos incluyen además las etapas de unir al menos una sonda, que tiene un aglutinante acoplado a una peroxidasa, a una o más dianas presentes en la muestra de la etapa, reaccionar la sonda unida con un sustrato de peroxidasa acoplado a un generador de señal fluorescente; y observar una señal procedente del generador de señal fluorescente. El procedimiento de unir, observar y oxidar se puede repetir de forma iterativa.

En algunas realizaciones se proporcionan kits para la detección de múltiples dianas en una muestra biológica. Los kits incluyen múltiples sondas que tienen un aglutinante acoplado a una enzima, y un sustrato enzimático acoplado a un generador de señal fluorescente. Cuando se aplica a la muestra, un agente oxidante inactiva sustancialmente tanto al generador de señal fluorescente, como a la enzima.

Descripción de las figuras La FIG.1 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 1 como función de la longitud de onda, tras 10 minutos y 15 minutos.

La FIG.2 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 1, 2 y 3 como función de la longitud de onda.

La FIG.3 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 4 como función de la longitud de onda, tras 30 minutos y 140 minutos.

La FIG.4 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 5 como función de la longitud de onda, tras 20 minutos, 2

60 minutos y 210 minutos.

La FIG.5 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 6 como función de la longitud de onda, tras 12 minutos y 16 minutos. La FIG.6 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 8 como función de la longitud de onda, tras 22 minutos, 70 minutos y 210 minutos. La FIG.7 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 9a, 10a y 11a como función de la longitud de onda. La FIG.8 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 9b y 10b como función de la longitud de onda. La FIG.9 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 12a y 12b como función de la longitud de onda. La FIG. 10 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 13, 14 y 15 como función de la longitud de onda. La FIG. 11 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 16 y 17 como función de la longitud de onda. La FIG. 12 muestra las micrografías (con un aumento 10x) de la Muestra 18A (antes de la modificación de la señal)

y la Muestra 18B (tras la modificación de la señal) .

La FIG. 13 muestra las micrografías (con un aumento 10x) de la Muestra 19A (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 19B (tras la modificación de la señal) . La FIG. 14 muestra las micrografías de la Muestra 20A (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 20B (tras la modificación de la señal) .

La FIG. 15 muestra las micrografías de las Muestras 21A y 21B (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 21C (tras la modificación de la señal) . La FIG. 16 muestra las micrografías de las Muestras 22A y 22B (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 22C (tras la modificación de la señal) . La FIG. 17 muestra las micrografías de las Muestras 23A-E. La FIG. 18 muestra las micrografías de la Muestra 24A (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 24b (tras la modificación de la señal) .

La FIG. 19 muestra las micrografías de la Muestra 25A (canales Cy3 y Cy5) , la Muestra 25B (canales Cy3 y Cy5) y las Muestras 25C-25J. La FIG. 20 muestra las micrografías de las Muestras 26A-H. La FIG. 21 muestra las micrografías de las Muestras 27A-C. La FIG. 22 muestra el gráfico de intensidad media de píxeles del fondo para cada ciclo en las imágenes del Ejemplo 20. La FIG. 23 muestra la comparación entre las micrografías de las Muestras 28A-C y 29A-C. La FIG. 24 muestra las micrografías de las Muestras 30A-D. La FIG. 25 muestra las micrografías de las Muestras 30C-F. La FIG. 26 muestra el gráfico de intensidad media de píxeles del fondo para cada ciclo en las Muestras 30C y 30D. La FIG. 27 muestra las micrografías de las Muestras 31A, 31B y 31C. La FIG. 28 muestra las micrografías de las Muestras 32A, 32B y 32C. La FIG. 29 muestra las micrografías de las Muestras 33, 34, 35 y 36. La FIG. 30 muestra las transferencias puntuales de las Muestras 37, 38, 39 y 40. La FIG. 31 muestra el gráfico de barras de las intensidades de señal relativas de las transferencias para las Muestras 37, 38, 39 y 40. La FIG. 32 muestra el perfil de tiempo de los espectros Cy3 y Cy5.

La FIG. 33 muestra los valores de absorbancia de Cy3 como función del tiempo para diferentes concentraciones de H2O2.

La FIG. 34 muestra los valores de absorbancia como función del tiempo para diferentes fluoróforos.

La FIG. 35 muestra los valores de absorbancia de QD 655 como función del tiempo para H2O2.

La FIG. 36 muestra los espectros de absorbancia para fluoresceína usando H2O2.

Descripción detallada Para describir y subrayar con más claridad y concisamente la materia objeto de la invención reivindicada se proporcionan las definiciones... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de sondar múltiples dianas en una muestra biológica, que comprende:

(a) proporcionar una muestra que contiene múltiples dianas;

(b) unir al menos una sonda, que comprende un aglutinante acoplado a una enzima, a una o más dianas 5 presentes en la muestra;

(c) hacer reaccionar la sonda unida con un sustrato enzimático acoplado a un generador de señal fluorescente;

(d) observar una señal procedente del generador de señal fluorescente de la etapa (c) ;

(e) aplicar a la muestra en la etapa (c) una solución, que comprende un agente oxidante que inactiva 10 sustancialmente tanto al generador de señal fluorescente, como a la enzima;

(f) unir al menos una sonda, que comprende un aglutinante acoplado a una enzima, a una o más dianas presentes en la muestra de la etapa (e) ;

(g) hacer reaccionar la sonda unida con un sustrato enzimático acoplado a un generador de señal fluorescente;

(h) observar una señal procedente del generador de señal fluorescente de la etapa (g) .

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la solución de la etapa (e) es una solución básica.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la enzima se selecciona de peroxidasa, fosfatasa alcalina, -D-galactosidasa y glucosa oxidasa.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el generador de señal fluorescente comprende un 20 pigmento de cianina.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las etapas (e) - (h) se repiten una o más veces.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de observación (d) , la etapa (h) o las etapas (d) y

(h) comprenden co-localizar al menos dos dianas en la muestra.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de observación (d) , la etapa (h) o las etapas (d) y 25 (h) comprenden una medición cuantitativa de al menos una diana en la muestra.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende medir uno o más valores de intensidad de la señal observada al observar la etapa (d) , la etapa (h) o las etapas (d) y (h) .

9. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende correlacionar el valor de la intensidad con una cantidad de la diana presente en la muestra.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el generador de señal fluorescente en la etapa (c) es el mismo que el generador de señal fluorescente en la etapa (g) .

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el generador de señal fluorescente en la etapa (c) es diferente del generador de señal fluorescente en la etapa (g) .

12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las señales observadas en la etapa (d) y la etapa (h) son 35 ambas detectables en la misma longitud de onda de la detección.

13. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la enzima es una peroxidasa y el sustrato enzimático es un sustrato de peroxidasa.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la peroxidasa provoca el sustrato de peroxidasa en

enlaces covalentes, en grupos fenólicos presentes en la muestra, o un soporte solido al que está unida la 40 muestra.