Producción de hidrógeno mediante la expresión heteróloga de una NAD(P)H deshidrogenasa de tipo II en Chlamydomonas.

Procedimiento para incrementar la capacidad de un alga verde de producir hidrógeno,

caracterizado porque comprende la transformación de dicha alga por un polinucleótido que codifica una NAD(P)H deshidrogenasa de tipo II (NDH-II), y la expresión de dicha NDH-II en dicha alga, en el que dicha NDH-II:

- presenta al menos un ejemplar del motivo de consenso GxGxxG en que "G" representa una glicina y "x" representa un aminoácido cualquiera,

- tiene la capacidad de catalizar la reducción de quinonas de las cadenas de transferencia de electrones mediante la oxidación de NADH o NDPH usando un cofactor flavínico, y

- es, en su forma activa, un monómero de 30 a 60 kDa o un homodímero.

Producción de hidrógeno mediante la expresión heteróloga de una NAD(P)H deshidrogenasa de tipo II en Chlamydomonas

La presente Invención se refiere a la mejora de la producción de hidrógeno por Chlamydomonas reinhardtii.

El hidrógeno es una materia prima esencial de la industria química, y constituye igualmente un combustible llamado a desempeñar un papel importante en los años futuros. Las pilas de combustible alimentadas por hidrógeno permiten, mediante la reacción del hidrógeno con el oxigeno del aire, producir electricidad de manera no contaminante, y no expulsando más que vapor de agua. Los avances tecnológicos en el campo de las pilas de combustible vuelven su uso a gran escala cada vez más factible.

Sin embargo, la mayor parte del hidrógeno usado actualmente se produce a partir de fuentes de energía fósiles, tales como petróleo o carbón, mediante técnicas generadoras por si mismas de contaminación, tales como la conversión catalítica de hidrocarburos del gas natural o el craqueo del petróleo o del carbón.

Parece por tanto deseable disponer de procedimientos rentables que permitan la producción de hidrógeno a partir de una fuente de energía primaria renovable y limpia (no liberadora de gas con efecto de invernadero).

Ciertas algas verdes unicelulares pertenecientes a los géneros Scenedesmus, Chlorococcum, Chlorelle (orden de las Chlorococcales), Lobochlamys y Chlamydomonas (orden de las Volvocales), tales como la especie Chlamydomonas reinhardtii, son capaces de producir hidrógeno a partir de energía solar, usando agua como donante de electrones y protones.

En estas algas, el hidrógeno se produce por una hidrogenasa con hierro, que tiene una alta actividad especifica. Esta enzima está conectada a la cadena fotosintétlca de transferencia de electrones PSI a través de un transportador de electrones común, la ferredoxlna. Los electrones necesarios para la producción de hidrógeno pueden proporcionarse al PSI por la actividad del PSII (ruta A) o por el uso de las reservas carbonadas a través de la reducción fotoquímica de plastoquinonas (ruta B). Estas dos rutas se esquematizan en la Figura 1.

Leyenda de la Figura 1: En línea continua, la ruta A dependiente del PSII; en linea de puntos, la ruta B apoyada en una reducción de plastoquinonas independiente del PSII.

PSI: fotosistema I; PSII: fostoslstema II; RuBP: 1,5-bisfosfato de ribulosa; LHC: complejo colector de luz; FNR: ferredoxina NDAP reductasa; Fd: ferredoxina; Pe: plastocianina; cytb6: citocromo b6; cytf; citocromo f; NDH: NADH deshidrogenasa; PQ(H)2: plastoquinol; Qa: quinona a; P68 y P7: centros reactivos de PSI y PSII, respectivamente.

En condiciones naturales, la producción de H2 no es más que un fenómeno transitorio. Efectivamente, el hidrógeno es muy sensible al O2. Ahora bien, la fotolisis del agua que interviene al nivel del fotosistema II, que proporciona electrones para la producción de H2 a través de la ruta A, produce igualmente O2 que induce una inhibición rápida de la hidrogenasa.

Se han propuesto diversas soluciones para remediar este problema. La primera solución se apoya en una producción en la oscuridad, las demás en una producción con luz usando en parte la ruta B que, al contrario que la ruta A, no conduce a la producción de oxígeno.

Por ejemplo, la patente U.S. 4.532.21 describe un procedimiento que alterna las fases de luz y oscuridad. En el transcurso de los periodos luminosos, las algas producen O2 y acumulan reservas de hidrocarburos producidos por fotosíntesis. Estas reservas se usan a continuación de forma anaeróbica durante las fases oscuras para producir hidrógeno. Este procedimiento necesita una purga de nitrógeno para alcanzar la anaerobia. Está limitado también por la eficacia de la producción de H2 en la oscuridad, que es inferior por un orden de magnitud a la producción con luz.

La solicitud U.S. 21/53543 describe un procedimiento basado en la inhibición reversible del fotosistema II por carencia de azufre. Este procedimiento comprende una etapa de cultivo de algas verdes con luz y en un medio con contenido normal de azufre, para permitirla acumulación de reservas de hidrocarburos, y una etapa de cultivo en recipientes sellados y con luz en un medio desprovisto de azufre. La inhibición del fotosistema II conlleva la suspensión de la producción de oxígeno por la fotosíntesis. Cuando las algas (cuya respiración no está inhibida por la carencia de azufre) han usado la totalidad del oxígeno presente en el medio, se vuelven anaeróbicas y usan las reservas de hidrocarburos constituidas gracias a la fotosíntesis para producir H2. La alternancia de fases de cultivo en presencia y ausencia de azufre permite una separación temporal de las fases luminosas de producción de O2 y H2.

La solicitud U.S. 23/162273 propone un procedimiento alternativo para inducir una carencia de azufre que inhiba el fotosistema II; se trata del uso de un alga modificada genéticamente que subexpresa una sulfato permeasa cloroplástica.

Los procedimientos descritos anteriormente permiten evitar la inhibición de hidrogenasa con hierro, al separar la producción de C^de la de H2. Sin embargo, la producción de hidrógeno por los tres procedimientos descritos anteriormente presenta limitaciones. El primer procedimiento se apoya en la actividad fermentativa del alga en la oscuridad, fenómeno poco eficaz que no conduce más que a una producción de hidrógeno marginal. El segundo y tercer procedimientos se apoyan en el funcionamiento paralelo de la rutas A y B. Al estar acompañada la ruta A de un desprendimiento de oxigeno, debe mantenerse a un nivel inferior al consumo de O2 respiratorio con el fin de mantener la anoxia. La ruta A está por tanto limitada por la capacidad respiratoria de las algas. La contribución de la ruta B es significativa pero limitada.

La presente invención tiene como objetivo mejorar el rendimiento de esta segunda ruta (B). Con este objetivo, los inventores han tenido la idea de usar en el cloroplasto una NADH deshidrogenasa de tipo II para estimular la reacción de reducción de plastoquinonas.

Las NADH deshidrogenasas de tipo I y II son enzimas capaces de reducir las quinonas de cadenas de transferencia de electrones. Están asociadas a las cadenas respiratorias mitocondriales y bacterianas (KERSCHER, Biochim. Biophvs. Acta 1459: 274-283, 2).

Las NADH deshidrogenasas de tipo I (NDH-I) son complejos multiméricos transmembrana que comprenden de 14 a aproximadamente 5 subunidades. Este tipo de complejo solo oxida la NADH y presenta una actividad asociada al bombeo de protones.

Las NAD(P)H deshidrogenasas de tipo II (NDH-II) son enzimas monoméricas de tipo oxidorreductasa de peso molecular comprendido entre 3 y 6 kDa capaces de reducir las quinonas de las cadenas respiratorias bacterianas o de las cadenas mitocondriales de plantas y levaduras, oxidando NADH o NADPH. Su asociación con las cadenas fotosintéticas de plantas y algas se ha propuesto igualmente, pero no se ha demostrado hasta hoy. Este tipo de enzima no se ha puesto de manifiesto en el reino animal.

En los cloroplastos de las plantas superiores, se ha demostrado la existencia de un complejo NDH-I funcional (BURROWS et al., EMBO J. 17: 868-876, 1998; SAZANOV et al., Proc. Nati. Acad. Sci, USA 95: 1319-1324, 1998; HORVATH ef al., Plant Phvsiol. 123: 1337-1349, 2) y se ha propuesto igualmente la existencia de una actividad de tipo NDH-II (CORNEILLE et al., Biochim. Biophvs. Acta 1363: 59-69, 1998). En Chlamydomonas reinhardtii, los genes que codifican el complejo NDH-I cloroplástico están ausentes. Sin embargo, se ha sugerido la existencia de una actividad de tipo NDH-II (COURNAC et al., Int. J. Hvdroa. Energy 27: 1229-1237, 22; PELTIER y COURNAC, Annu. Rev. Plant Biol. 53: 523-55, 22).

En particular, COURNAC et al. (Int. J. Hvdroa. Energy 27: 1229-1237, 22) se interesa en la producción de hidrógeno en Chlamydomonas reinhardtii y en la cianobacteria Synechocystis. Los autores han estudiado el sistema de transferencia de electrones y han puesto de manifiesto en Chlamydomonas que la reducción no fotoquímica de plastoquinonas necesita una NAD(P)H-PQ oxidorreductasa que deber ser una NADH de tipo II.

La presente invención se define por las reivindicaciones 1 a 5 siguientes.

Los inventores describen el uso de una NAD(P)H deshidrogenasa de tipo II (NDH-II), o de un polinucleótido que codifica dicha proteína, para aumentar la capacidad de un alga verde de producir hidrógeno.

Según un modo de realización preferido, dicha alga verde es un alga verde unicelular, elegida con preferencia entre las Chlorococcales, especialmente los géneros Scenedesmus, Chlorococcum, Chlorella, y las Volvocales, especialmente los géneros... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para incrementar la capacidad de un alga verde de producir hidrógeno, caracterizado porque comprende la transformación de dicha alga por un polinucleótido que codifica una NAD(P)H deshidrogenasa de tipo II (NDH-II), y la expresión de dicha NDH-II en dicha alga, en el que dicha NDH-II:

- presenta al menos un ejemplar del motivo de consenso GxGxxG en que "G" representa una glicina y "x" representa un aminoácido cualquiera,

- tiene la capacidad de catalizar la reducción de quinonas de las cadenas de transferencia de electrones mediante la oxidación de NADH o NDPH usando un cofactorflavínlco, y

- es, en su forma activa, un monómero de 3 a 6 kDa o un homodímero.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha NDH-II es una NDH-II muíante obtenida a partir de una NDH-II que usa preferiblemente NADH, mediante sustitución del residuo glutamato o aspartato situado al final de la segunda lámina p del motivo p-a-p de enlace de nucleótidos piridínicos por un residuo polar neutro.

3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque dicha NDH-II se elige entre:

- la NDH-II Agtundh2 de Agrobacteríum tumefaciens, definida por la secuencia SEQ ID NO : 2, o una NDH-II muíante obtenida a partir de Agtundh2 por sustitución del residuo de glutamato en posición 21 de la secuencia SEQ ID NO: 2 por un residuo de glutamina;

- la NDH-II N2Cr2 de Chlamydomonas reinhardtii, definida por la secuencia SEQ ID NO: 4, o por un fragmento de la misma que comprende los aminoácidos 67-619 de la secuencia SEQ ID NO: 4, o una NDH-II muíante obtenida a partir de N2Cr2 por sustitución del residuo de glutamato en posición 285 de la secuencia SEQ ID NO: 4 por un residuo de glutamina.

4. Alga verde transformada por un nucleótido que codifica una NDH-II tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Uso de un alga verde según la reivindicación 4 para la producción de hidrógeno.