Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN.

Una molécula de ácido nucleico de miARN sintético que comprende una secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de miR-181a humana madura para su uso en una terapia de un cáncer o para tratar enfermedades inflamatorias.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10183490.

Solicitante: Asuragen, Inc.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 2150 Woodward St Suite 100 Austin TX 78744 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: BROWN, DAVID, DEVROE,ERIC, FORD,LANCE, CHENG,ANGIE, JARVIS,RICH, BYROM,MIKE, OVCHARENKO,DMITRIY, KELNAR,KEVIN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/11 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
  • C12N15/113 C12N 15/00 […] › Acidos nucleicos no codificantes que modulan la expresión de genes, p.ej. oligonucleótidos antisentido.
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2534301_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas Inhibidoras de miARN

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la biología molecular. Más particularmente, se refiere a procedimientos y composiciones que implican moléculas de ácido nucleico que simulan mlcroARN (miARN) y que inhiben miARN. Se describen procedimientos y composiciones que implican miARN sintéticos y moléculas inhibidoras de miARN. Además, también se describen procedimientos y composiciones para identificar miARN que contribuyen a procesos celulares. Además, la Identificación de miARN que contribuyen a procesos celulares proporciona dianas para intervención terapéutica así como análisis de diagnóstico y/o pronóstico.

2. Descripción de la técnica relacionada

En 2001, varios grupos usaron un nuevo procedimiento de clonación para aislar e Identificar un gran grupo de "microARN" (miARN) de C. elegans, Drosophila y seres humanos (Lagos-Quintana y col., 2001; Lau y col., 2001; Lee y Ambros, 2001). Se han identificado varios cientos de miARN en plantas y animales, Incluyendo seres humanos, que no parecen tener ARNip endógenos. Por lo tanto, aunque son similares a los ARNIp, los miARN son no obstante distintos.

Los miARN observados hasta la fecha han sido de aproximadamente 21-22 nucleótidos de longitud y surgen de precursores más largos, que se transcriben de genes no codificantes de proteínas. Véase la revisión de Carrington y col. (2003). Los precursores forman estructuras que se pliegan entre sí en reglones autocomplementarias; después se procesan por la nucleasa Dicer en animales o DCL1 en plantas. Las moléculas de miARN Interrumpen la traducción mediante formación de pares de bases precisa o imprecisa con sus dianas.

Los miARN parecen estar implicados en la regulación génica. Algunos miARN, Incluyendo lin-4 y let-7, Inhiben la síntesis proteica uniéndose con regiones no traducidas 3 parcialmente complementarias (3 UTR) de ARNm diana. Otros, incluyendo el miARN Scarecrow hallado en plantas, actúan como ARNip y se unen con secuencias de ARNm perfectamente complementarias para destruir el transcrito diana (Grishok y col., 2001).

La investigación sobre microARN está aumentando a medida que los científicos comienzan a apreciar el papel general que estas moléculas desempeñan en la regulación de la expresión génica eucariota. Los dos miARN mejor entendidos, lin-4 y let-7, regulan la temporlzaclón del desarrollo en C. elegans regulando la traducción de una familia de ARNm clave (revisado en Pasquinelli, 2002). Se han identificado varios cientos de miARN en C. elegans, Drosophila, ratón y seres humanos. Como se esperaría para moléculas que regulan la expresión génica, se ha mostrado que los niveles de miARN varían entre tejidos y estados del desarrollo. Además, un estudio muestra una fuerte correlación entre la expresión reducida de dos miARN y la leucemia linfocítica crónica, proporcionando una posible conexión entre miARN y cáncer (Calin, 2002). Aunque el campo aún es joven, se especula que los miARN podrían ser tan importantes como los factores de transcripción en la regulación de la expresión génica en eucariotas superiores.

Hay algunos ejemplos de miARN que desempeñan papeles críticos en la diferenciación celular, desarrollo temprano y procesos celulares como apoptosls y metabolismo de grasas, lin-4 y let-7 regulan ambos el paso de un estado larvario a otro durante el desarrollo de C. elegans (Ambros, 2003). Mir-14 y bantam son miARN de Drosophila que regulan la muerte celular, aparentemente regulando la expresión de genes implicados en la apoptosls (Brennecke y col., 2003, Xu y col., 2003). El miR14 también se ha Implicado en el metabolismo de grasas (Xu y col., 2003). Lsy-6 y miR-273 son miARN de C. elegans que regulan la simetría en neuronas quimiosensoriales (Chang y col., 2004). Otro miARN animal que regula la diferenciación celular es m¡R-181, que guía la diferenciación de células hematopoyéticas (Chen y col., 2004). Estas moléculas representan la serie completa de miARN animales con funciones conocidas. Además, el documento WO 03/029459 desvela el miARN m¡R-181a. El entendimiento potenciado de las funciones de miARN revelará sin duda redes reguladoras que contribuyan al desarrollo normal, diferenciación, comunicación Ínter e intracelular, ciclo celular, anglogénesls, apoptosls y muchos otros procesos celulares. Dados sus papeles importantes en muchas funciones biológicas, es probable que los miARN ofrezcan puntos importantes para intervención terapéutica o análisis de diagnóstico.

Caracterizar las funciones de biomoléculas como miARN implica con frecuencia introducir las moléculas en células o retirar las moléculas de células y medir el resultado. Si la introducción de un miARN en células da como resultado apoptosis, entonces el miARN participa sin duda en una ruta apoptótlca. Se han descrito procedimientos para introducir o retirar miARN de células. Dos publicaciones recientes describen moléculas antlsentldo que pueden usarse para inhibir la actividad de miARN específicos (Meister y col., 2004; Hutvagner y col., 2004). Otra publicación describe el uso de plásmidos que se transcriben por ARN pollmerasas endógenas y producen miARN específicos cuando se usan para transfectar células (Zeng y col., 2002). Estos dos conjuntos de reactivos se han usado para evaluar miARN individuales.

Una limitación del sistema de expresión de miARN basado en plásmidos es que las eficacias de transfección para plásmidos tienden a ser muy bajas, expresando solamente aproximadamente el 50 % de las células ARN del

plásmido en células que son fáciles de transfectar. Las eficacias de transfección para plásmidos en células primarias son mucho más bajas, expresando menos del 10 % de las células típicamente el ARN deseado. Por lo tanto, existe la necesidad de composiciones y procedimientos alternativos para introducir moléculas de miARN en células de modo que puedan caracterizarse y estudiarse.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico de miARN sintética que comprende una secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de miR-181a humana madura para su uso en una terapia de un cáncer o para enfermedades inflamatorias. También se proporciona un ácido nucleico de miARN sintético bicatenario de 17-30 nucleótidos de longitud que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia con una secuencia de miR-181a madura que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 39-61 de SEC ID N°: 124, nucleótidos 36-59 de SEC ID N°: 125, nucleótidos 16-39 de SEC ID N°: 127 y nucleótidos 27-48 de SEC ID N°: 126, y un segundo polinucleótido separado cuya secuencia de 5 a 3 es entre 60 % y 100 % complementaria del primer polinucleótido para su uso como un medicamento.

También se proporciona el uso de un ácido nucleico de miARN sintético como se ha mencionado anteriormente para reducir o aumentar la viabilidad celular o proliferación celular o para inducir la apoptosis, a condición de que se excluyan procedimientos para el tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia. Se definen realizaciones adicionales de la invención en las reivindicaciones. La siguiente descripción detallada se refiere a la presente invención en la medida del alcance de las reivindicaciones.

El término "miARN" se usa de acuerdo con su significado habitual y corriente y se refiere a una molécula de microARN hallada en eucariotas que está implicada en la regulación génica basada en ARN. Véase, por ejemplo, Carrington y col., 2003, que se incorpora por la presente por referencia. En general, el término se usará para hacer referencia a la molécula de ARN monocatenaria procesada a partir de un precursor. Se han identificado miARN individuales y se han secuenciado en diferentes organismos, y se les han dado nombres. Se proporcionan en el presente documento nombres de miARN y sus secuencias.

La presente invención se refiere, en algunas realizaciones de la invención, a moléculas de ácido nucleico cortas que actúan como miARN o como inhibidores de miARN en una célula. El término "corto" se refiere a una longitud de un único polinucleótido que es de 150 nucleótidos o menos. Las moléculas de ácido nucleico son sintéticas. El término "sintético" significa que la molécula de ácido nucleico está aislada y no es idéntica en su secuencia (la secuencia completa) y/o estructura química a una molécula de ácido nucleico de origen natural, tal como una molécula de miARN precursora endógena. Aunque en algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de la... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una molécula de ácido nucleico de miARN sintético que comprende una secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de miR-181a humana madura para su uso en una terapia de un cáncer o para tratar enfermedades inflamatorias.

2. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer o para tratar enfermedades inflamatorias de acuerdo con la reivindicación 1 definido además como una molécula de ácido nucleico de entre 17 y 125 restos de longitud, que comprende:

una reglón de miARN cuya secuencia de 5 a 3 es al menos 80 % idéntica a un miARN maduro de miR-181a, y

una reglón complementaria cuya secuencia de 5 a 3 es entre 60 % y 100 % complementaria de la región de miARN.

3. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer o para tratar enfermedades inflamatorias de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende una región de miARN cuya secuencia de 5 a 3 es al menos 85 % Idéntica a una secuencia de miR-181a madura.

4. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer o para tratar enfermedades inflamatorias de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende una región de miARN cuya secuencia de 5 a 3 es al menos 90 % Idéntica a una secuencia de miR-181a madura.

5. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer o para tratar enfermedades inflamatorias de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, que comprende una región de miARN cuya secuencia de 5 a 3 es idéntica a una secuencia de miR-181a madura.

6. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer o para tratar enfermedades inflamatorias de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ácido nucleico está comprendido por dos polinucleótidos separados.

7. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer o para tratar enfermedades inflamatorias de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ácido nucleico es una molécula en horquilla.

8. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer o para tratar enfermedades Inflamatorias de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para administración a una célula o un paciente que tiene la célula identificada como que necesita una terapia de un cáncer.

9. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer o para tratar enfermedades Inflamatorias de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en una terapia para tratar cáncer de pulmón o cáncer de piel.

10. Ácido nucleico de miARN sintético como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en el tratamiento de enfermedades Inflamatorias.

11. Un ácido nucleico de miARN sintético blcatenario de 17-30 nucleótidos de longitud que comprende un primer polinucleótido que tiene una secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia con una secuencia de miR- 181a madura que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 39-61 de SEC ID N°: 124, nucleótidos 36-59 de SEC ID N°: 125, nucleótidos 16-39 de SEC ID N°: 127 y nucleótidos 27-48 de SEC ID N°: 126, y un segundo polinucleótido separado cuya secuencia de 5 a 3 es entre 60 % y 100 % complementaria del primer polinucleótido para su uso como un medicamento.

12. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque el ácido nucleico es como se define adlclonalmente en una cualquiera de las reinvidicaciones 2 a 7.

13. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento de acuerdo con las reivindicaciones 11o 12 que comprende además uno o más de los siguientes:

I) un grupo de reemplazo para fosfato o hidroxilo del nucleótldo en el extremo 5 de la cadena complementarla de la molécula de ARN;

¡I) una o más modificaciones de azúcares en los primeros o últimos 1 a 6 restos de la reglón complementarla; o iii) no complementariedad entre uno o más nucleótidos en los últimos 1 a 5 restos en el extremo 3 de la región complementarla y los nucleótidos correspondientes de la reglón de miARN.

14. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, que comprende I) al menos un nucleótldo modificado que bloquea el 5 OH o fosfato en el extremo 5, en el que la al menos una modificación de nucleótldo es una modificación de NH2, biotina, un grupo amina, un grupo de alqullamina Inferior, un grupo acetilo o 2oxígeno-metllo(20-Me) o ¡I) al menos una modificación de ribosa seleccionada de 2F,

2 NH2, 2N3i 4tio o 2 0-CH3.

15. Ácido nucleico de miARN sintético para su uso como un medicamento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 que es un polinucleótido bicatenario.

16. Uso de un ácido nucleico de miARN sintético como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 5 para aumentar la viabilidad celular, reducir o aumentar la proliferación celular o para Inducir la apoptosis, con la

condición de que los procedimientos para el tratamiento del cuerpo humano o animal por cirugía o terapia estén excluidos.


 

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