Procedimiento y sistema de calibración de un modulador óptico espacial en un microscopio óptico.

Procedimiento de calibración de un dispositivo óptico con modulador óptico espacial (6),

comprendiendo dicho dispositivo un punto de origen luminoso (1), un objetivo óptico (8) de gran apertura digital adecuada para recibir un haz incidente y/o para recoger un haz óptico reflejado por una muestra, una cámara (14) dispuesta en un plano conjugado ópticamente con el plano focal del objetivo (8) y un modulador óptico espacial (6) dispuesto en el haz óptico aguas arriba de la cámara (14), comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:

a) colocación de una muestra plana reflectante (10) cerca del plano focal del objetivo (8),

b) aplicación de un mando de amplitud Ri j sobre un elemento Pi del modulador óptico espacial (6), de manera que se module el haz óptico incidente y/o reflejado sobre la muestra (10),

c) adquisición de una imagen de la respuesta impulsional excitadora, PSF, en intensidad en un plano conjugado del plano focal del objetivo (8),

d) modificación de la distancia axial relativa entre el objetivo (8) y la muestra (10) reflectante en una cantidad Z conocida;

e) iteración de las etapas c) y d) para una pluralidad de distancias axiales relativas entre la muestra (10) y el plano focal del objetivo (8);

f) reconstrucción del perfil en amplitud y/o en fase del haz en un plano conjugado del plano focal del objetivo por un algoritmo de diversidad de fase para un valor Ri j de un elemento Pi;

g) iteración, j, de las etapas b) a f) para una pluralidad de valores de amplitud Ri j para un elemento Pi del modulador optico espacial (6);

h) determinación de la función de influencia Ei de un elemento Pi sobre el perfil en amplitud A y/o en fase j del haz a partir de los perfiles obtenidos en la etapa f;

i) iteración de las etapas b) a h) para los diferentes elementos Pi i≥1, ..., N del modulador optico espacial (6);

j) determinación de las funciones de influencias (E1, ... EN) del conjunto de los elementos P1, ... PN del modulador óptico espacial (6) sobre el perfil en amplitud A y/o en fase j del haz.

Procedimiento y sistema de calibración de un modulador óptico espacial en un microscopio óptico.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento y a un sistema de calibración de un dispositivo óptico con modulador óptico espacial. Más precisamente, la invención se refiere a un procedimiento y a un dispositivo para calibrar la influencia de un modulador óptico espacial colocado en o aguas arriba de un microscopio óptico, sobre la calidad de las imágenes obtenidas en este microscopio.

Estado de la técnica

El desarrollo de nuevas técnicas de formación de imágenes en microscopía óptica (microscopía confocal, por iluminación estructurada, microscopía de fluorescencia de barrido, de depleción por emisión estimulada (STED) , técnicas de óptica no lineal, etc.) y de nuevas aplicaciones en formación de imágenes biológicas o biomédicas, necesita unos microscopios ópticos que producen unas imágenes de excelente calidad. La microscopía de objetos planos o situados en el aire da generalmente unas imágenes de resolución muy alta. Sin embargo, la microscopía óptica de muestras biológicas gruesas encuentra problemas de aberraciones ópticas que limitan la resolución espacial de las imágenes. Estas aberraciones ópticas pueden proceder del objetivo del microscopio, de una desadaptación de índice entre el objetivo, el medio de inmersión y la muestra o también de la naturaleza de la muestra en sí, que puede presentar unas variaciones internas locales de índice de refracción.

La utilización de moduladores ópticos espaciales en un microscopio ya se ha propuesto para modular espacialmente un haz óptico de amplitud y/o de fase o para corregir las aberraciones ópticas. De manera general, un modulador óptico espacial es un dispositivo que permite modular el perfil espacial del campo incidente de amplitud y/o de fase. Entre los moduladores ópticos espaciales se encuentran en particular los espejos deformables provistos de accionadores así como de moduladores espaciales de luz (SL) o Spatial Light Modulator) de cristales líquidos. En la continuación de la descripción, se entiende por modulador óptico espacial un componente óptico que comprende una pluralidad de elementos unidos a unos medios de mando para modular la amplitud y/o la fase de un haz luminoso. Las diferentes tecnologías de modulación óptica espacial permiten funcionar en reflexión o en transmisión con unos rendimientos variables en términos de resolución espacial, tiempo de respuesta y respuesta en longitud de onda. Por ejemplo, un modulador espacial de cristales líquidos permite modular un haz con una resolución espacial muy buena, pudiendo cada píxel ser mandado individualmente.

La utilización de un espejo cuya superficie puede ser deformada por unos accionadores encuentra aplicaciones en óptica activa para mejorar la calidad de las imágenes producidas por unos instrumentos ópticos y en óptica adaptativa para modular un frente de onda a una frecuencia temporal elevada. La óptica adaptativa se utiliza en particular en los grandes telescopios destinados a la observación en astronomía para corregir en tiempo real las deformaciones de la imagen inducidas por las turbulencias atmosféricas. En formación de imágenes microscópica, las aberraciones ópticas pueden variar de una muestra a otra, pero en la mayoría de las aplicaciones, la variación de las aberraciones en una imagen es relativamente lenta en función del tiempo. Sin embargo, en ciertas aplicaciones de microscopía, también puede ser necesario optimizar muy rápidamente la calidad de la imagen detectada. La óptica adaptativa se ha propuesto por lo tanto como una solución para compensar las aberraciones ópticas en un microscopio y mejorar los límites de resolución en formación de imágenes microscópica, en particular en aplicaciones de biología.

En un microscopio de óptica adaptativa, se utiliza generalmente un espejo deformable para inducir una modulación del frente de onda del haz luminoso excitador y eventualmente también una modulación de la señal recogida a través del objetivo del microscopio. Esta modulación se traduce por una variación del perfil de amplitud y de fase a la entrada del objetivo del microscopio, induciendo en sí mismo una variación de la respuesta de impulso excitadora (Point Spread Function o PSF) del microscopio. La PSF representa la respuesta de un sistema óptico a un punto de origen y describe cómo cada punto de un objeto es modificado por el sistema óptico para formar la imagen resultante observada en intensidad.

Según el tipo de muestra observado en microscopía, se desea poder aplicar las deformaciones precisas para compensar por ejemplo el astigmatismo o también un desenfoque del haz. Así, la publicación D. Débarre et al. "Image-based adaptative optics for two-photon microscopy", Optics Letters, Vol. 34, n° 16, p. 2495-2497 describe la mejora de imágenes de microscopía por la utilización de un espejo deformable mandado por unas funciones predefinidas del tipo combinaciones de modos de Zernike.

En el caso de un modulador espacial de cristales líquidos, el mando de cada píxel produce una modulación de fase a priori conocido píxel por píxel. Sin embargo, el posicionamiento exacto del SLM con respecto al haz es generalmente desconocido. Ahora bien, la influencia exacta de un modulador óptico espacial de amplitud y/o de fase sobre un haz óptico depende al mismo tiempo de la posición y del tamaño del haz óptico con respecto al modulador óptico espacial. Esta influencia no es generalmente conocida de antemano, ya sea en el plano focal de un

dispositivo óptico, es decir, cuando el haz óptico está enfocado, o bien en el plano de la pupila, en el que se extiende el haz óptico.

Ciertamente, existen unos procedimientos para calibrar, por ejemplo, un espejo deformable en un telescopio o en un microscopio.

Un primer grupo de técnicas de calibración está basado en el análisis de la fase del frente de onda en el plano de la pupila después de la reflexión sobre un espejo deformable. Una primera solución está basada en la utilización de un analizador de frente de onda, por ejemplo de tipo Shack-Hartmann, que permite una medición de las deformaciones locales del frente de onda de un haz óptico. Sin embargo, un analizador del frente de onda es costoso y presenta límites geométricos. El acoplamiento de un SHS a un microscopio es restringido ya que el diámetro de haz detectado es limitado (de aproximadamente 5 mm) , por lo tanto es necesario adaptar la ampliación del haz entre la pupila de entrada del microscopio y el analizador del frente de onda para cada objetivo de microscopio para el cual el espejo deformable debe ser calibrado. Además, la resolución espacial de la fase por un analizador de tipo Shack-Hartmann está limitada a aproximadamente 30x30 píxeles.

Una segunda solución se basa en la medición y el análisis de franjas de interferencias en un interferómetro de tipo Michelson o Twyman-Green, para deducir las variaciones de fase del frente de onda. Así, la publicación D. Débarre et al. "Image-based adaptative optics for two-photon microscopy", Optics Letters, Vol. 34, n°16, p. 2495-2 497, utiliza un espejo situado en el plano focal del objetivo con el fin de calibrar específicamente la región del espejo reproducida en la pupila trasera del objetivo. Sin embargo, las mediciones interferométricas requieren un procedimiento de alineación minucioso y necesitan una fuente que tiene una gran longitud de coherencia. En las aplicaciones de microscopía que utilizan un haz láser de impulso, el interferómetro necesita otra fuente óptica, que está generalmente dispuesta en otra posición y en otra longitud de onda distinta de la de la aplicación considerada. Además, un interferómetro presenta un volumen difícilmente compatible con un microscopio.

Otro grupo de técnicas se basa en una medición de la respuesta de impulso (o PSF) en intensidad en el plano focal del dispositivo y en un cálculo de reconstrucción del frente de onda de amplitud y/o de fase, por ejemplo siguiendo un método denominado de diversidad de fase. La medición de respuesta de impulso consiste generalmente en adquirir la imagen de un punto de origen colocado en el plano focal del dispositivo a través del dispositivo óptico a caracterizar. El método de diversidad de fase consiste en primer lugar en medir por lo menos dos imágenes de un mismo objeto con un desfase conocido entre las dos imágenes, en segundo lugar en modelizar el campo complejo en el plano de Fourier de cada imagen, frecuentemente descomponiendo la fase en una base de polinomios de Zernike, y finalmente en aplicar un algoritmo de minimización sobre los campos que corresponden a las... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de calibración de un dispositivo óptico con modulador óptico espacial (6) , comprendiendo dicho dispositivo un punto de origen luminoso (1) , un objetivo óptico (8) de gran apertura digital adecuada para recibir un haz incidente y/o para recoger un haz óptico reflejado por una muestra, una cámara (14) dispuesta en un plano conjugado ópticamente con el plano focal del objetivo (8) y un modulador óptico espacial (6) dispuesto en el haz óptico aguas arriba de la cámara (14) , comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:

a) colocación de una muestra plana reflectante (10) cerca del plano focal del objetivo (8) , b) aplicación de un mando de amplitud Rij sobre un elemento Pi del modulador óptico espacial (6) , de manera que se module el haz óptico incidente y/o reflejado sobre la muestra (10) , c) adquisición de una imagen de la respuesta impulsional excitadora, PSF, en intensidad en un plano conjugado del plano focal del objetivo (8) , d) modificación de la distancia axial relativa entre el objetivo (8) y la muestra (10) reflectante en una cantidad Z

conocida;

e) iteración de las etapas c) y d) para una pluralidad de distancias axiales relativas entre la muestra (10) y el plano focal del objetivo (8) ;

f) reconstrucción del perfil en amplitud y/o en fase del haz en un plano conjugado del plano focal del objetivo por un algoritmo de diversidad de fase para un valor Rij de un elemento Pi;

g) iteración, j, de las etapas b) a f) para una pluralidad de valores de amplitud Rij para un elemento Pi del modulador óptico espacial (6) ;

h) determinación de la función de influencia Ei de un elemento Pi sobre el perfil en amplitud A y/o en fase del haz a partir de los perfiles obtenidos en la etapa f; i) iteración de las etapas b) a h) para los diferentes elementos Pi i=1, ..., N del modulador óptico espacial (6) ; j) determinación de las funciones de influencias (E1, ... EN) del conjunto de los elementos P1, ... PN del modulador óptico espacial (6) sobre el perfil en amplitud A y/o en fase del haz.

2. Procedimiento de calibración según la reivindicación 1, caracterizado por que las mediciones de PSF se efectúan para tres distancias axiales relativas entre el objetivo (8) y la muestra (10) definidas con respecto a la posición de la muestra en el plano focal del objetivo tales que: z = (-z0, 0, + z0) .

3. Procedimiento de calibración según la reivindicación 2, caracterizado por que la etapa f) de reconstrucción del perfil en amplitud y/o en fase del haz comprende las etapas siguientes: -estimación de un término de desenfoque que corresponde a las tres posiciones relativas: -z0, 0 y +z0; -estimación inicial del perfil del campo en la pupila de entrada del objetivo; -estimación del perfil de transmisión de la pupila de entrada del objetivo; -cálculo de tres perfiles de campo por multiplicación del perfil del campo estimado en la pupila de entrada del objetivo, respectivamente, por cada uno de los tres términos de desenfoque; -aplicación de una transformada de Fourier para calcular las PSF estimadas para las tres posiciones relativas: -z0, 0 y +z0; -sustitución de la amplitud de las PSF calculadas por el valor de las PSF medidas respectivamente para cada uno de los valores de z (-z0; 0; +z0) ; -aplicación de una transformada de Fourier inversa para los tres campos obtenidos; -división por el término de desenfoque que corresponde respectivamente a cada posición z (-z0; 0; +z0) ; -media de los tres campos complejos obtenidos;

- multiplicación de la media de los campos por el perfil de transmisión de la pupila de entrada del objetivo, para obtener una nueva estimación del perfil del campo a nivel de la pupila trasera del objetivo;

- iteración del conjunto de las etapas del algoritmo de cálculo de reconstrucción del perfil en amplitud y/o en fase hasta que se cumpla una condición de terminación.

4. Procedimiento de calibración según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que comprende una etapa suplementaria previa a la etapa j) , consistiendo dicha etapa suplementaria en una iteración de las etapas b) a i) para diferentes combinaciones de mandos simultáneos de una pluralidad de elementos.

5. Procedimiento de calibración según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que comprende, después de la etapa c) , una etapa suplementaria de filtrado digital de las imágenes de PSF medidas de manera que la resolución espacial disminuya y/o la dimensión de las imágenes se adapten al tamaño de la pupila (9) del objetivo (8) .

6. Procedimiento de calibración según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que comprende, después de la etapa j) , una etapa suplementaria de inversión de las funciones de influencia del conjunto de los elementos P1, ... PN del modulador óptico espacial modulador óptico espacial (6) en amplitud A (x, y) = MA (Rit) y/o Rit = MA-1 (A (x, y) ) y respectivamente en fase (x, y) = M (Rit) y/o Rit = M -1 ( (x, y) ) .

7. Sistema de calibración de un dispositivo óptico con modulador óptico espacial (6) , comprendiendo dicho dispositivo un punto de origen luminoso (1) que genera un haz incidente (1a) , un objetivo óptico (8) de gran apertura digital adecuado para recibir un haz incidente y/o para recoger un haz óptico reflejado por una muestra, estando una imagen del punto de origen (1) formada en el plano focal del objetivo (8) , comprendiendo un modulador óptico espacial (6) una pluralidad de elementos (P1, ... PN) y unos medios de mando de dichos elementos (P1, ... PN) , estando el modulador óptico espacial (6) dispuesto en el haz óptico de manera que module el haz óptico incidente y/o reflejado, comprendiendo dicho sistema de calibración:

- una muestra (10) plana reflectante dispuesta cerca del plano focal del objetivo (8) ;

- un medio de ajuste (11) de la distancia z entre el plano focal del objetivo (8) y dicha muestra (10) ;

- un sistema óptico (8, 12, 13) adecuado para recibir una parte del haz reflejado por dicha muestra (10) y para formar una imagen del plano focal del objetivo (8) en un plano conjugado;

- una cámara (14) dispuesta en dicho plano conjugado ópticamente con el plano focal del objetivo (8) ; y 35

- un sistema de control (15) que comprende una unidad de mando del medio de ajuste (11) de la distancia z, una unidad de mando de los elementos (P1, ... Pi, ... PN) del modulador óptico espacial adaptada para proporcionar una pluralidad de valores de amplitud (6) , una unidad de tratamiento de las imágenes adquiridas por la cámara (14) para una pluralidad de distancias z adecuada para deducir una medición de la respuesta impulsional excitadora, PSF, del dispositivo y unos medios de cálculo adecuados para determinar los valores de los mandos a aplicar respectivamente sobre el medio de ajuste (11) de la distancia z y sobre los elementos del modulador óptico espacial (6) en función de las mediciones de la PSF.

8. Sistema de calibración según la reivindicación 7, caracterizado por que los medios de cálculo comprenden unos 45 medios de reconstrucción del perfil en amplitud y/o en fase del haz utilizando un algoritmo de diversidad de fase.

9. Sistema de calibración según la reivindicación 8, caracterizado por que los medios de cálculo comprenden unos medios de determinación de las funciones de influencias (E1, ... EN) del conjunto de los elementos P1, ... PN del modulador óptico espacial (6) sobre el perfil en amplitud A y/o en fase del haz.

10. Sistema de calibración según la reivindicación 9, caracterizado por que los medios de cálculo comprenden unos medios de inversión de las funciones de influencia del conjunto de los elementos P1, ... PN del modulador óptico espacial (6) por un algoritmo de regresión lineal y unos medios de minimización para deducir una calibración del modulador óptico espacial (6) .