Nuevos mutantes de proteína de superficie del antígeno de superficie del virus HVB de Hepatitis B (HBsAg).

Un oligo- o polipéptido que comprende

(a) una secuencia de aminoácidos que es una secuencia parcial de la SEQ ID No:

3 que tiene al menos 75 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID No: 3, donde esta secuencia parcial incluye todas las ocho posiciones 100, 105, 110, 118, 120, 142, 160 y 173 de la SEQ ID No: 3; o

(b) un fragmento de un antígeno HBs de un virus de hepatitis B, donde el fragmento tiene una longitud de al menos 15 aminoácidos, el antígeno HBs tiene cisteína en la posición 100, arginina en la posición 105, leucina en la posición 110, arginina en la posición 118, leucina en la posición 120, leucina en la posición 142, asparagina en la posición 160 y prolina en la posición 173, y el fragmento comprende cisteína 100, arginina 105, arginina 118, leucina 120, leucina 142, asparagina 160 y prolina 173.

Nuevos mutantes de proteína de superficie del antígeno de superficie del virus HVB de Hepatitis B (HBsAg) .

La invención se refiere a secuencias de un nuevo mutante o variante del antígeno de superficie (HBsAg) de la hepatitis B, a métodos para detectar esta variante de genoma y de proteína así como a anticuerpos dirigidos contra la misma en muestras de pacientes. 5

Las nuevas secuencias conducen a 7 intercambios (sustituciones) de aminoácidos aún no conocidas en esta combinación en el antígeno HBsAg de superficie de hepatitis B en el rango de las posiciones de aminoácidos 100 a 180 de la secuencia de aminoácidos del antígeno de superficie, en cuyo caso se encuentran seis sustituciones en la región del a-determinante (aa 101 hasta aa 180) así como a una sustitución en la vecindad inmediata de la misma (aa 100) . 10

La invención se refiere también a métodos de detección inmunoquímicos para la detección simultánea de esta nueva variante de HBV conjuntamente con variantes/subtipos conocidos, así como al uso de las nuevas secuencias en conexión con secuencias conocidas para detectar simultáneamente anticuerpos específicos de HBV. Las determinaciones de antígeno y de anticuerpos pueden realizarse respectivamente en un lote de muestras de manera diferenciada o no diferenciada. 15

Finalmente, la invención también se refiere a la detección de los ácidos nucleicos correspondientes con ayuda del llamado ensayo de ácido nucleico (por ejemplo, Polymerase Chain Reaction, PCR o Reacción en Cadena de Polimerasa) con ayuda de cebadores adecuados, así como al uso de las nuevas secuencias de aminoácidos para producir vacunas.

Se sabe que el virus de la hepatitis B (HBV por Hepatitis B Virus) induce una cantidad de desórdenes, desde 20 infecciones suaves no aparentes hasta inflamaciones hepáticas crónicamente activas y de curso fulminante (hepatitis viral) .

La infección crónica con HBV representa un problema de salud global con cálculos de 400 millones de personas afectadas (Lee, N. Engl. J. Med. 337; 1733-1745 (1997) )

Las medidas profilácticas más adecuadas para la infección con HBV que puede encontrarse frecuentemente en todo 25 el mundo, se consideran la inmunización activa (estimulación de la respuesta de anticuerpos mediante administración de antígeno) y también la inmunización pasiva (mediante inyección de anticuerpos preformados) .

El HBV pertenece a los virus Hepadna y representa una partícula de virus con un diámetro de 42 nm la cual está compuesto de un núcleo y una envoltura. El genoma del virus es una secuencia de ADN parcialmente bicatenario, anular de aproximadamente 3200 nucleótidos, que codifican al menos seis genes virales diferentes (Tiollais et al., 30 Nature 317: 489-495 (1985) ) . Existen cuatro marcos abiertos de lectura para la formación de las proteínas virales.

En el gen S se encuentra la información para el antígeno (HBsAg) de superficie (surface) de HBV, que también se llama proteína pequeña (small protein, S) . Además, existen formas más grandes que se designan como proteína grande (large protein, L) y proteína media (middle protein, M) . Todas las tres proteínas tienen en común la secuencia de S-HBsAg que comprende 226 aminoácidos (Gerlich et al., Viral Hepatitis and Liver Disease (Hepatitis y 35 enfermedad hepática) , Hollinger et al., William-Wilkens, Baltimore, MD, pages 121-134 (1991) ) .

Las regiones de proteína antes de la small HBs se denominan también Pre-S1 y Pre-S2. El dominio de Pre-S1 comprende, independientemente del genotipo, 108 o 119 aminoácidos, mientras que el dominio Pre-S2 se compone de 55 aminoácidos. Ambos dominios están contenidos en la proteína L (389 o 400 aminoácidos, según el genotipo) mientras que la proteína M solamente comprende la Pre-S2 altamente con el antígeno S (281 aminoácidos) . Las 40 proteínas Pre-S presentan diferentes grados de glicosilación y portan los receptores para reconocer las células hepáticas.

El gen C porta la información para la proteína de nucleocápside, antígeno-núcleo de hepatitis B (HBcAg) . La traducción de esta proteína puede iniciar ya en la región Pre-C y conducir a la formación de antígeno de hepatitis Be (HBeAg) . El HBeAg presenta frente a HBcAg otro plegamiento e inmunogenidad. HBeAg, en contraste con HBcAg, 45 aparece libre en el suero y en caso de detección positiva se considera un indicador de la formación de HBcAg y por lo tanto de la formación de partículas infecciosas de virus.

Las transcripciones inversas de polimerasa-ADN contenidas en las partículas de virus se codifican por el gen P y para el gen X transactivador se discute un papel causal en la generación de carcinomas primarios de células hepáticas asociados con HBV. 50

El ciclo de replicación viral de HBV comprende un ARN pre-genómico intracelular que se transcribe al ADN en la nucleocápside viral. Puesto que la polimerasa de ADN de transcriptasa inversa propia de HBV no dispone de exactitud-legibilidad (proof-reading capability) , con relativamente alta frecuencia se incorporan nucleótidos equivocados. Como consecuencia el HBV tiene una tasa de mutación, la cual con aproximadamente 1 nucleótido/10000 bases/año de infección corresponde aproximadamente a un múltiplo de 10 de la que tienen otros 5 virus ADN (Blum, Digestion 56: 85-95 (1995) ; Okamoto et al., Jpn. J. Exp. Med. 57: 231-236 (1987) ) . Además, también aparecen supresiones e inserciones con bastante frecuencia (Carman et al., Lancet 341: 349-353 (1993) ) .

La variabilidad resultante de HBV se manifiesta entre otros en la aparición de 9 subtipos definidos serológicamente (Courouce et al., Bibliotheca Haematologica 42: 1 (1976) ) y en total de al menos 8 diferentes fenotipos que se denominan A hasta H (figura 1) y tienen una distribución geográfica. (Norder et al., J. Gen. Virol. 73: 3141-3145 10 (1992) , Norder et al., Virology 198: 489-503 (1994) , Norder et al.; Intervirology 47:289-309 (2004) ) . Además, se describe una serie de mutantes en los que un aminoácido o más se presentan intercambiados, faltan o sobran.

Además de las mutaciones que tienen lugar de modo natural (Cooreman et al., Hepatology 30: 1287-1292 (1999) una adición de inmunoglobulina de HBV y/o una terapia antiviral (por ejemplo, con lamivudina) puede ejercer una presión de selección la cual conduce a la aparición multiplicada de los llamados "mutantes de escape" y puede 15 incrementarse ostensiblemente la probabilidad de aparición de mutantes HBV (Terrault et al., Hepatology 28: 555-561 (1998) ; Tillmann et al., Hepatology 30: 244-256 (1999) ; Hunt et al., Hepatology 31: 1037-1044 (2000) .

No todas las mutaciones de HBV conducen a virus capaces de replicación y con frecuencia existe una coexistencia con un virus capaz de replicación, lo cual también limita la exactitud de secuenciación de ADN aislado puede conducir incluso a no reconocer secuencias modificadas por PCR, trabajos de clonación con secuenciación 20 posterior, si esta constituye cuantitativamente < 10 % de todo el ADN (Cooreman et al., J. Biomed. Sci. 8: 237-247 (2001) .

Por lo tanto, el aislamiento de mutantes es ventajoso, en cuyo caso la identificación y caracterización posteriores de mutantes individuales conduce posiblemente a vacunas y/o diagnósticos mejorados.

La respuesta inmune después de una infección con HBV está dirigida principalmente contra el llamado a-25 determinante como una región de la proteína S, común a todos los virus de hepatitis B, el cual se encuentra en la superficie de la partícula de virus (Gerlich et al., supra) y representa la parte más heterogénea del epítopo B de célula del gen S.

Como lugares de enlace para anticuerpos, de acuerdo con el estado del conocimiento actual, se aceptan al menos 5 epítopos que se solapan parcialmente sobre el a-determinante en la posición de aminoácido 101 y 180 (figuras 1 y 30 2) tal como ha podido mostrarse mediante la aplicación de anticuerpos monoclonales (Peterson et al., J. Immunol. 132: 920-927 (1984) ) . Éstos son principalmente epítopos complejos de conformación, estabilizados por una pluralidad de puentes de disulfuro. En algunos casos también se presentan epítopos secuenciales que pueden producirse con la ayuda de estructuras peptídicas cíclicas, preparadas sintéticamente.

Los llamados "cuerpos protectores", que circulan en el suero después de una infección natural con HBV, están 35 dirigidos en un 99% contra el a-determinante muy inmunogénico del HBV (Jilg, Vaccine 16: 65-68 (1998) . En este hecho se apoya la aplicación amplia de la inmunización con vacunas, las cuales han sido aisladas del suero humano, o bien han sido producidas mediante ingeniería genética y la administración... [Seguir leyendo]

1. Un oligo- o polipéptido que comprende

(a) una secuencia de aminoácidos que es una secuencia parcial de la SEQ ID No: 3 que tiene al menos 75 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID No: 3, donde esta secuencia parcial incluye todas las ocho posiciones 100, 105, 110, 118, 120, 142, 160 y 173 de la SEQ ID No: 3; o 5

(b) un fragmento de un antígeno HBs de un virus de hepatitis B, donde el fragmento tiene una longitud de al menos 15 aminoácidos, el antígeno HBs tiene cisteína en la posición 100, arginina en la posición 105, leucina en la posición 110, arginina en la posición 118, leucina en la posición 120, leucina en la posición 142, asparagina en la posición 160 y prolina en la posición 173, y el fragmento comprende cisteína 100, arginina 105, arginina 118, leucina 120, leucina 142, asparagina 160 y prolina 173. 10

2. Un oligo- o polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1, el cual reacciona con sueros de individuos infectados por la variante de virus de hepatitis B, que comprende una secuencia de nucleótido que codifican una secuencia de aminoácidos la cual incluye SEQ ID No: 4.

3. Un oligo- o polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1 o 2, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo consistente en SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 y SEQ ID No: 5. 15

4. Un oligo- o polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótido que codifica un oligo- o polipéptido tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un oligo- o polinucleótido complementario al mismo.

5. Un oligo- o polinucleótido como se reivindica en la reivindicación 4, el cual comprende una secuencia de nucleótido que consiste en la SEQ ID No: 2.

6. Un vector o plásmido que comprenden un oligo- o polinucleótido como se reivindica en cualquiera de las 20 reivindicaciones 4 a 5.

7. Una célula que ha sido transformada o transfectadas con un vector o plásmido como se reivindican en la reivindicación 6.

8. Una célula que comprende un oligo- o polinucleótido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5 o un vector o un plásmido como se reivindican en la reivindicación 6. 25

9. Un método para preparar un oligo- o polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el cual comprende cultivar una célula como se reivindica en la reivindicación 7 o 8 en condiciones adecuadas de modo que se exprese el oligo- o polipéptido.

10. El método como se reivindica en la reivindicación 9, en el cual el oligo- o polipéptido se obtiene de las células y se separan de otros oligo- o polipéptidos. 30

11. Un kit de ensayo para detectar virus de hepatitis B que comprende un oligo- o polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

12. Un péptido inmunogénico o mezcla de péptidos inmunogénicos que comprende uno o más oligo- o polipéptidos como se reivindican en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 solos o en combinación con inmunogenes conocidos de HBV. 35

13. Un método para detectar anticuerpos dirigidos contra un virus de hepatitis B, caracterizado porque (a) se incuba una muestra con un oligo- o polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo; y

(b) se detecta el complejo de anticuerpo-antígeno que comprende el oligo- o polipéptido.

14. Un virus de hepatitis B aislado que incluye un antígeno HBs que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ 40 ID No: 5.