Nueva proteína Cry de Bacillus thuringiensis con actividad insecticida para combatir un hemíptero.

Nueva proteína Cry de Bacillus thuringiensis con actividad insecticida para combatir un hemíptero.

La invención se refiere a un nuevo gen que codifica una proteína Cry (o delta-endotoxina), a la propia proteína codificada por dicho gen, a los sistemas para la expresión de la misma (vectores y células hospedadoras), y a la utilización de dicho gen y/o dicha proteína para combatir plagas de hemípteros, con preferencia por el pulgón verde, Myzus persicae, tanto mediante el uso de una composición que contenga la nueva proteína y/o un sistema para su expresión, como mediante plantas transgénicas en las que se expresa el gen. Dichas composiciones y plantas transgénicas son de especial interés, pues la proteína nueva proteína Cry presenta una capacidad insecticida con Myzus persicae especialmente buena, en comparación con otras proteínas Cry conocidas, que presentaban una capacidad insecticida reducida contra áfidos y no se conocía ninguna activa con Myzus persicae.

Nueva proteína Cry de Bacillus thuringiensis con actividad insecticida para combatir un hemíptero

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de los biopesticidas y de las plantas transgénicas capaces de expresarlos. Más concretamente, la invención se refiere a un nuevo gen que codifica una proteína Cry (o delta-endotoxina), a la propia proteína codificada por dicho gen, a los sistemas para la expresión de la misma (vectores y células hospedadoras), y a la utilización de dicho gen y/o dicha proteína para combatir plagas de Myzus persicae (Sulzer), el áfido comúnmente conocido como pulgón verde, tanto mediante el uso de una composición que contenga la proteína como mediante plantas transgénicas en las que se expresa el gen.

Antecedentes de la invención

Bacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria Gram positiva, ubicua y esporulante que frecuentemente sintetiza diversas proteínas (Cry, Cyt y Vip) con actividad insecticida contra una amplia gama de insectos que causan plagas tales como lepidópteros (Dulmage, 1970; Estruch et al., 1996), coleópteros (Estruch and Yu, 1998; Krieg et al., 1983), dípteros (Federici et al., 2003; Goldberg, 1977) y hemípteros (Porcar et al., 2009; Sattar and Maiti, 2011). Bt produce proteínas insecticidas durante la esporulación que aparecen como cristales paraesporales, cristales que están compuestos predominantemente de una o más proteínas Cry o Cyt. Las proteínas Cry se denominan así porque son las proteínas de las inclusiones paraesporales (cristales, que dan lugar a la abreviatura Cry) de Bt que presentan un efecto tóxico experimentalmente verificable frente a un organismo diana o que tienen una similitud de secuencia significativa con una proteína Cry conocida, mientras que las proteínas Cyt son las proteínas de las inclusiones paraesporales de Bt que exhiben actividad hemolítica (citolítica, que da lugar a la abreviatura Cyt) o que tienen una similitud de secuencia significativa con una proteína Cyt conocida.

Las proteínas Cry pertenecen a una clase de toxinas bacterianas conocidas como toxinas formadoras de poros. Las proteínas Cry de Bt en particular no exhiben actividad insecticida hasta que no han sido ingeridas y solubilizadas en el intestino del insecto, donde la forma ingerida (protoxina) es hidrolizada por proteasas para dar lugar a la

molécula tóxica activa (toxina). Junto con algunas proteínas Cyt, se engloban dentro del grupo de las delta-endotoxinas. Las proteínas Cry generalmente presentan cinco bloques de secuencia conservados, y tres dominios estructurales conservados: dominio I o dominio N, dominio II o dominio M y dominio III o dominio C, que reciben esa denominación por las regiones donde aparecen en la proteína: zona del extremo amino (N), zona media (M) y zona del extremo carboxilo (C). Esos tres dominios estructurales son responsables de su actividad insecticida contra distintas especies de insectos, así como también contra células cancerígenas de origen humano (parasporinas) (Ohba et al., 2009). De estos últimos, se considera que los dominios M y C en particular están implicados en el reconocimiento y unión al receptor, y se consideran por ello determinantes de su especificidad como toxinas. El dominio III (dominio C) presenta a menudo una homología estructural con proteínas que se unen a hidratos de carbono como el dominio de unión a celulosa de la 1,4-p-glucanasa C, galactosa oxidasa, sialidasa, (3-glucoronidasa, el dominio de unión a hidratos de carbono de la xilanasa U y (3-galactosidasa. La forma de protoxina de muchas proteínas Cry presenta una extensión en el extremo carboxilo que hace que su longitud sea mayor que la de otras protoxinas de la familia, extensión que se considera dispensable para la toxicidad pero que se cree que juega un papel en la formación de los cuerpos de inclusión cristalinos dentro de la bacteria.

Los insecticidas basados en delta-endotoxinas han tenido un uso intensivo, que ha dado lugar incluso a la aparición de resistencias en algunas especies.

Dentro del orden de los hemípteros (Hemiptera), la familia de los afididos o áfidos (Aphididae), más conocidos como pulgones, contiene gran número de parásitos de plantas angiospermas, que originan algunas de las principales plagas que afectan a diferentes cultivos agrícolas. El pulgón verde, Myzus persicae (Sulzer, 1776), es una de las principales plagas polífagas en muchas regiones del mundo (Harrington, 2007) incluida España (Diaz et al., 2006). Afecta también a un gran número de cultivos agrícolas de gran importancia económica (Harrington, 2007), entre los que se incluyen distintos frutales (como los de algunos cítricos, el melocotonero y otros árboles del género Prunus) y cultivos herbáceos como solanáceas, gramíneas y cruciferas. En dichos cultivos no sólo produce daños directos por alimentación, sino también por ser un eficiente vector transmisor de varios virus fitopatógenos causantes de enfermedades vegetales muy perjudiciales (Nebreda et al., 2004). Es más, recientemente se ha descrito que esta especie se ha hecho resistente a algunos de los insecticidas químicos de

síntesis más comúnmente utilizados para su control en Europa (Slater et al., 2012).

Actualmente, se conocen varias proteínas Cry de Bt con actividad insecticida contra áfidos. Sin embargo, no han resultado especialmente tóxicas contra estos insectos, ya que son necesarias elevadas dosis para matar entre el 50% y el 100% de los insectos tratados (Chougule and Bonning, 2012; Porcar et al., 2009). La Tabla 1 que se muestra a continuación resume las toxicidades conocidas de proteínas Cry contra especies de áfidos que causan plagas, de acuerdo con los datos de Chougule and Bonning (Chougule and Boning, 2012).

Tabla 1

Toxicidades conocidas de proteínas Cry contra áfidos causantes de plagas

La solicitud de patente internacional WO2010099365 (perteneciente a la misma familia que la patente de EE.UU. US8318900B2), se refiere a secuencias nucleotídicas que codifican proteínas que presentan homología con las delta-endotoxinas, a composiciones que comprenden dichas proteínas y a métodos para conferir resistencia contra plagas a bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas mediante la transformación de dichos organismos con dichas secuencias nucleotídicas. La solicitud WO2010099365 divulga tanto secuencias naturales de genes identificados en distintas cepas de Bacillus thuringiensis (SEQ ID NOs:1 a 47 de dicha solicitud) como secuencias sintéticas preparadas a partir de las anteriores (SEQ ID Nos:97 a 196 de dicha solicitud WO2010099365), que dan lugar a proteínas que carecen del "dominio cristalino" C- terminal presente en la mayor parte de las delta-endotoxinas. En la solicitud WO2010099365 se cita Myzus persicae como una de las posibles plagas a combatir. Sin embargo, la solicitud no menciona ningún ensayo en el que se pruebe la eficiencia para combatir dicho áfido de las composiciones y métodos divulgados en el documento WO2010099365, aunque sí se definen unas pautas generales para posibles ensayos de áfidos en el Ejemplo 20, sin mostrar preferencia por el uso de ninguna de las delta- endotoxinas divulgadas en el documento. El Ejemplo 19 de dicha solicitud describe un

ensayo en el que se prueba la eficacia contra otro áfido, Aphis glycines, de proteínas sintéticas derivadas de la proteína Axmi171 (un homólogo lejano de la proteína Cry12Aa2, codificado por la secuencia insertada en la construcción descrita en la secuencia número 204 de la solicitud WO2010099365 y de la patente US8318900B2, secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos identificada con el número 205); el máximo valor de mortalidad obtenido, 2 (es decir, 25-50% de los recipientes mostraban 100% de mortalidad) sólo se consigue con un extracto concentrado de E. coli que expresa la forma de la proteína que carece del dominio N-terminal o con una forma de la proteína obtenida tras escindir con el factor Xa una proteína de fusión que incluía la proteína de unión a la maltosa y resuspender en agua el precipitado formado, mientras que el resto de las variantes dieron lugar a 0-25% de los recipientes con 100% de mortalidad. Sin embargo, en el ejemplo anterior, el Ejemplo 18, se describen ensayos realizados también con derivados... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una delta-endotoxina, caracterizada por que la secuencia de nucleótidos que codifica una delta-endotoxina está representada por SEQ ID NO:1 o presenta al menos un 90% de identidad con la misma.

2. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos que codifica una delta-endotoxina presenta al menos un porcentaje de identidad con la secuencia representada por SEQ ID NO:1 que se selecciona del grupo de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%.

3. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2, en la que la secuencia de nucleótidos que codifica una delta-endotoxina que comprende un fragmento de secuencia que codifica un dominio tipo ricina b que presenta al menos un 90% de identidad con la secuencia codificante de los aminoácidos 652-799 de SEQ ID NO:2.

4. Molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una delta- endotoxina que tiene actividad contra al menos un insecto hemíptero.

5. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una delta-endotoxina que tiene actividad contra al menos una especie de áfido.

6. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una delta-endotoxina que tiene actividad contra el áfido Myzus persicae.

7. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, cuya secuencia de nucleótidos está representada por SEQ ID NO:1.

8. Molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la secuencia de nucleótidos que codifica una delta-endotoxina está operativamente unida a un promotor.

9. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8, en la que el promotor se selecciona del grupo de un promotor capaz de dirigir la expresión de dicha secuencia de nucleótidos en una célula de planta, en una bacteria que se selecciona del grupo de Escherichia coli, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas spp., o en una célula de Saccharomyces cerevisiae.

10. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8 ó 9, que adicionalmente está operativamente unido a una secuencia de control adicional al promotor.

11. Un vector en el que está inserta una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Vector según la reivindicación 11, que es un plásmido.

13. Vector según la reivindicación 12, que es un vector de expresión que permite la expresión en una bacteria de la secuencia de nucleótidos que codifica una delta- endotoxina representada por SEQ ID NO:1 o de una secuencia codificante que presenta al menos un 90% de identidad con la misma.

14. Vector según la reivindicación 12, en el que la bacteria se selecciona del grupo de Escherichia coli, Pseudomonas spp., Bacillus megaterium o Bacillus thuringiensis.

15. Vector según la reivindicación 11 ó 12, que es un vector de transformación de plantas.

16. Vector según la reivindicación 15, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica la delta-endotoxina representada por SEQ ID NO:1 o la secuencia codificante que presenta al menos un 90% de identidad con la misma está operativamente unida a un promotor capaz de dirigir la expresión de dicha secuencia de nucleótidos en una célula de planta.

17. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en que la secuencia codificante de la delta-endotoxina representada por SEQ ID NO:1 o la secuencia codificante que presenta al menos un 90% de identidad con la misma está unida en fase de lectura a la secuencia codificante de un segundo polipéptido.

18. Una célula hospedadora que comprende un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17.

19. Célula hospedadora según la reivindicación 18, que es una célula de levadura.

20. Célula hospedadora según la reivindicación 18, que es una célula de bacteria.

21. Célula hospedadora según la reivindicación 20, que es una célula de una bacteria que se elige del grupo de Escherichia coli, Pseudomonas spp., Bacillus megaterium o Bacillus thuringiensis.

22. Célula hospedadora según la reivindicación 18, que es una célula de planta.

23. Una planta transgénica que comprende la célula hospedadora de la reivindicación 22.

24. Una semilla transgénica que comprende una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

25. Planta transgénica según la reivindicación 23 o semilla transgénica según la reivindicación 24, que se selecciona del grupo de melocotonero, albaricoquero, ciruelo, almendro, otras especies del género Prunus, cítricos, patata, tomate y otras especies de la familia Solanaceae, tabaco, remolacha, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, apio, mostaza, pimiento, calabaza, alcachofa, espárrago, judías, brécol, coles de Bruselas, repollo, coliflor, col, col rizada, zanahoria, pepino, nabo, berenjena, lechuga, perejil, chirivía, guisante, alfalfa, pimiento, rábano, espinaca, berro, sandía, melón, maíz, sorgo, mijo, trigo, cebada, centeno, avena, arroz, soja, colza, cártamo, maní, batata, yuca, café, coco, pina, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, papaya, olivo, algodón, coniferas, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, claveles, flor de pascua, y crisantemos.

26. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos caracterizada por que dicha secuencia de aminoácidos:

a) es la representada por SEQ ID NO:2;

b) es la secuencia de una delta-endotoxina que está codificada por la secuencia representada por SEQ ID NO:1 o por una secuencia que presenta al menos un 90% de identidad con la misma, o

c) es la secuencia de una delta-endotoxina que presenta al menos un 80% de identidad con la secuencia representada por SEQ ID NO:2.

27. Polipéptido según la reivindicación 26, en el que la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO:2 o la delta-endotoxina definida en los apartados b) ó c) de la reivindicación 26 presenta tres dominios estructurales que se corresponden con los dominios N, M y C de las proteínas Cry.

28. Polipéptido según la reivindicación 26 ó 27, que comprende una secuencia de aminoácidos que es la secuencia de una delta-endotoxina que presenta al menos un 80% de identidad con la secuencia representada por SEQ ID NO:2, en el que el porcentaje de identidad se selecciona del grupo de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%.

29. Polipéptido según la reivindicación 26, cuya secuencia está representada por SEQ ID NO:2.

30. Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, que presenta actividad insecticida contra al menos un hemíptero.

31. Polipéptido según la reivindicación 30, que presenta actividad insecticida contra al menos un áfido.

32. Polipéptido según la reivindicación 31, que presenta actividad insecticida contra Myzus persicae.

33. Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 32, en el que la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO:2 o que corresponde a una delta-endotoxina codificada por una secuencia que presenta al menos un 90% de identidad con SEQ ID NO:1 o que corresponde a una delta-endotoxina que presenta al menos un 80% de identidad con la secuencia representada por SEQ ID NO:2, está ligada a un segundo polipéptido, formando una proteína de fusión.

34. Una composición que comprende un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 33, un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17 y/o una célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22.

35. Composición según la reivindicación 34, que adicionalmente comprende un excipiente agronómicamente aceptable y/o un vehículo agronómicamente aceptable.

36. Composición según la reivindicación 34 ó 35, que comprende una célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21.

37. Composición según la reivindicación 36, en la que las células hospedadoras se seleccionan entre las células de las especies Pseudomonas spp., Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis Bt 4Q7 o Saccharomyces cerivisae.

38. Composición según la reivindicación 34 ó 35, que comprende un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 33, en forma cristalina o solubilizada en un vehículo líquido.

39. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 38, que está en forma de polvo, granulado, emulsión, coloide, suspensión o solución.

40. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 39, que comprende un compuesto plaguicida adicional, un compuesto que incremente la acción plaguicida o esporas de Bacillus thuringiensis.

41. Uso de una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 40 para combatir plagas de al menos un hemíptero.

42. Uso según la reivindicación 41, en el que el hemíptero es un áfido.

43. Uso según la reivindicación 42, en el que el áfido es Myzus persicae.

44. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 43, en el que la plaga a combatir afecta a una planta, un cultivo de plantas, o a los productos de la cosecha de los mismos.

45. Uso según la reivindicación 44, en el que la planta se selecciona del grupo de melocotonero, albaricoquero, ciruelo, almendro, otras especies del género Prunus, cítricos, patata, tomate y otras especies de la familia Solanaceae, tabaco, remolacha, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, apio, mostaza, pimiento, calabaza, alcachofa, espárrago, judías, brécol, coles de Bruselas, repollo, coliflor, col, col rizada, zanahoria, pepino, nabo, berenjena, lechuga, perejil, chirivía, guisante, alfalfa, pimiento, rábano, espinaca, berro, sandía, melón, maíz, sorgo, mijo, trigo, cebada, centeno, avena, arroz, soja, colza, cártamo, maní, batata, yuca, café, coco, piña, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, papaya, olivo, algodón, coníferas, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, claveles, flor de pascua, y crisantemos.

46. Un método para la producción de un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 33, que comprende:

a) obtener un organismo recombinante que exprese el polipéptido de la presente invención;

b) cultivar dicho organismo recombinante;

c) inducir, de ser necesario, la expresión del polipéptido en dicho organismo recombinante;

d) purificar el polipéptido a partir del organismo recombinante.

47. Método según la reivindicación 46, en el que el organismo recombinante es una planta transgénica.

48. Método según la reivindicación 46, en el que el organismo recombinante es una célula hospedadora de la presente invención, una bacteria recombinante o una levadura recombinante

49. Un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 33.

50. Anticuerpo según la reivindicación 49, que se une específicamente al fragmento del polipéptido cuya secuencia:

a) es la representada por SEQ ID NO:2;

b) es la secuencia de una delta-endotoxina que está codificada por la secuencia representada por SEQ ID NO:1 o por una secuencia que presenta al menos un 90% de identidad con la misma, o

5 c) es la secuencia de una delta-endotoxina que presenta al menos un 80% de

identidad con la secuencia representada por SEQ ID NO:2.

51. Anticuerpo según la reivindicación 50, que se une específicamente a la secuencia representada por SEQ ID NO:2.

52. Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 49 a 51, que es un anticuerpo monoclonal.