Método para la determinación simultánea de varias proteasas de coagulación.

Método para la determinación del potencial de anticoagulación de un paciente,

en donde se determina simultáneamente la inhibición de la actividad de un primer y un segundo factores proteolíticos de coagulación en una única carga de ensayo, en el cual se mezcla una muestra del paciente con un primer sustrato cromogénico con especificidad por el primer factor de coagulación proteolítico y con un segundo sustrato cromogénico con especificidad por el segundo factor de coagulación proteolítico y con cantidades definidas del primer y del segundo factor de coagulación proteolítico y en donde se determina fotométricamente la inhibición del cambio de absorción en la carga de ensayo, caracterizado porque el primer sustrato cromogénico exhibe un cromóforo cuyo máximo de absorción se desvía por lo menos 100 nm del máximo de absorción del cromóforo del segundo sustrato cromogénico.

Método para la determinación simultánea de varias proteasas de coagulación

La presente invención está en el ámbito del diagnóstico de coagulación y se refiere a un método para la determinación simultánea de la actividad de varias proteasas de coagulación, es decir la determinación simultánea de la inhibición de varias proteasas de coagulación.

Las terapias corrientes de anticoagulación pretenden en primera línea la inhibición de los factores de coagulación que favorecen la coagulación trombina (Factor lia) y Factor Xa. Se diferencia entre anticoagulación oral con antagonistas de vitamina K, como por ejemplo cumadina, mediante la cual se provoca una inhibición de la síntesis del factor de coagulación, y anticoagulación mediante la inhibición de los factores activos de coagulación en la corriente sanguínea. Los anticoagulantes, los cuales inhiben o bien inactivan los factores activos de coagulación en la corriente sanguínea, se diferencian entre anticoagulantes con efecto directo e indirecto. Los anticoagulantes con efecto indirecto, como por ejemplo Rivaroxaban, Dabigatran o Melagatran se unen a la trombina o al Factor Xa y son con ello altamente específicos. Los anticoagulantes con efecto indirecto, como por ejemplo heparina, se unen a los inhibidores de factor de coagulación endógeno, como por ejemplo antitrombina, y fortalecen en varias veces su efecto de anticoagulación.

Todos los anticoagulantes que inhiben los factores activos de coagulación en la corriente sanguínea, se distinguen por un patrón específico de inactivación. Determinadas categorías de sustancias, como por ejemplo heparina no fraccionada de alto peso molecular, inhiben tanto trombina como también Factor Xa. Otras sustancias actúan de manera altamente específica, inhiben por consiguiente trombina (por ejemplo Hirudin, Dabigatran, Melagatran) o Factor Xa (por ejemplo pentasacáridos como Fondaparinux, Rivaroxaban).

Algunas veces, en el curso del tratamiento de una enfermedad tromboembólica se cambia el anticoagulante. Es clásica la transición de heparina (inhibición de trombina y Factor Xa en la corriente sanguínea) a cumadina (inhibición de la síntesis de factor de coagulación en el hígado) en el tratamiento de trombosis venosa profunda de las piernas. En tales cambios de la terapia puede cambiarse la inactivación relativa de trombina y Factor Xa en la corriente sanguínea. Para el control de la terapia y la dosificación de los medicamentos es importante conocer la actividad o sea la inhibición de trombina y de Factor Xa. De allí que es necesario poder determinar de manera fiable la actividad o bien la inhibición de los factores activos de coagulación trombina y Factor Xa en la sangre de un paciente.

En el diagnóstico de coagulación se diferencian las denominadas pruebas globales para la investigación de la funcionalidad de la cascada de coagulación de la sangre, y las denominadas pruebas individuales para la determinación de la actividad de factores individuales de coagulación de la sangre. Tanto para las pruebas globales como también para las pruebas individuales se conocen diferentes formatos de prueba. En referencia al formato de prueba, se diferencian esencialmente pruebas de coagulación y pruebas cromogénicas.

En una prueba cromogénica se mezcla la muestra de paciente que va a ser investigada, que consiste usualmente en plasma, con un activador de coagulación y con un sustrato para un factor de coagulación. Puesto que la mayoría de factores de coagulación de la sangre son endopeptidasas de serina, por consiguiente hidrolasas, que pueden escindir las uniones peptídicas, se emplean predominantemente sustratos de péptidos, que son escindidos de la manera más específica posible de los factores de coagulación de la sangre que van a ser determinados y que exhiben un grupo de señales detectables. De la forma más preferida se emplean grupos de señal cromogénicos o fluorogénicos, que pueden ser determinados fotométricamente. En los documentos de patente WO 2004/041840 A2, EP 0034122 A1 y US 4, 508, 644 se describe una multiplicidad de sustratos de péptido cromogénicos y su uso en pruebas de diagnóstico de coagulación, por ejemplo para la determinación de los factores de coagulación proteolíticos Factor lia (trombina) y Xa. En el documento EP 0078764 A1 se describe un método cromogénico para la determinación del factor de coagulación proteolítico XIla.

En particular con ayuda de las pruebas cromogénicas pueden determinarse en muestras de pacientes también anticoagulantes, que inhiben la actividad de factores de coagulación de la sangre. Para ello se mezcla la muestra de paciente que va a ser investigada comúnmente con un factor activado de coagulación y con un sustrato para este factor de coagulación. Cuanto más anticoagulante esté presente en la muestra, más fuertemente se inhibe el factor activado de coagulación y menos sustrato es escindido.

Para las pruebas cromogénicas establecidas, también obtenibles comercialmente, se emplean en particular los cromóforos para-nitroanilina (pNA) y ácido 5-amino-2-nitro-benzoico (ANBA), que exhiben un máximo de absorción a 405 nm. Por regla general, el color amarillo que se forma es determinado de manera fotométrica. En la determinación de anticoagulantes, la concentración de color en la carga de prueba se comporta de manera inversamente proporcional a la concentración de anticoagulante en la muestra.

Para poder determinar la inhibición de trombina y Factor Xa, es necesario ejecutar dos pruebas separadas, en las cuales se determina en cada caso la inhibición de uno de los dos factores de coagulación. Sería deseable la determinación simultánea de la actividad o bien inhibición de ambos factores de coagulación en una carga única de prueba. Esto tendría la ventaja de que se reduciría el gasto en material y tiempo y que podrían ejecutarse ambas determinaciones bajo las mismas condiciones, mediante lo cual se evitarían desviaciones en la ejecución de la prueba, como por ejemplo errores en la transferencia con pipeta, que podrían conducir a que pudiera surgir un error de identificación de la relación de ambos resultados.

De allí que la presente invención basó su objetivo en poner a disposición un método que haga posible la determinación simultánea de la inhibición de trombina y Factor Xa en una única carga de prueba. En la WO 2006/072602 A1 se describe un método para la determinación simultánea de trombina y plasmina, una enzima del sistema fibrinolítico, en donde se emplean sustratos fluorescentes. En US 5,510,243 se describe un método cromogénico para la determinación simultánea de diferentes bacterias.

El objetivo en el que se basa la invención se logra mediante la mezcla de una muestra con un primer sustrato cromogénico con especificidad por el primer factor de coagulación proteolítico y con un segundo sustrato cromogénico con especificidad por el segundo factor de coagulación proteolítico y con cantidades definidas del primer y segundo factores de coagulación proteolíticos, en donde el primer sustrato cromogénico exhibe un cromóforo, cuyo máximo de absorción se desvía por lo menos 100 nm del máximo de absorción del cromóforo del segundo sustrato cromogénico. Las señales cromogénicas que surgen pueden ser separadas espectralmente y podrían ser determinadas fotométricamente independientemente una de otra a diferentes longitudes de onda.

El método para la determinación simultánea de la actividad de dos factores proteolíticos de coagulación, que se añaden a la muestra del paciente, es empleado de acuerdo con la invención para analizar el potencial de anticoagulación de un paciente. Para ello se mezcla la muestra del paciente con cantidades definidas de por lo menos dos factores de coagulación proteolíticos que favorecen la coagulación y con los dos sustratos cromogénicos con especificidad por los factores de coagulación añadidos, y se determina la inhibición de la actividad proteolítica de los factores de coagulación. Cuanto mayor es el potencial de anticoagulación del paciente, es decir cuanto más anticoagulante tiene la muestra, más fuertemente inhibido(s) es/son el/los factor(es) de coagulación activados(s) que favorece(n) la coagulación y menor es la escisión de sustrato. La inhibición de la actividad proteolítica de los factores de coagulación puede ser determinada de manera cuantitativa mediante la comparación con una prueba de control, en la cual como muestra se emplea una muestra normal, que no contiene ningún anticoagulante, por ejemplo plasma humano normal.

Cuáles factores activados de coagulación se añaden, depende de cuáles anticoagulantes debieran ser determinados.

Para la determinación de una heparina,... [Seguir leyendo]

1. Método para la determinación del potencial de anticoagulación de un paciente, en donde se determina simultáneamente la inhibición de la actividad de un primer y un segundo factores proteolíticos de coagulación en una única carga de ensayo, en el cual se mezcla una muestra del paciente con un primer sustrato cromogénico con especificidad por el primer factor de coagulación proteolítico y con un segundo sustrato cromogénico con especificidad por el segundo factor de coagulación proteolítico y con cantidades definidas del primer y del segundo factor de coagulación proteolítico y en donde se determina fotométricamente la inhibición del cambio de absorción en la carga de ensayo, caracterizado porque el primer sustrato cromogénico exhibe un cromóforo cuyo máximo de absorción se desvía por lo menos 100 nm del máximo de absorción del cromóforo del segundo sustrato cromogénico.

2. Método según la reivindicación 1, en donde el primero y el segundo factores proteolíticos de coagulación son elegidos de entre el grupo de trombina, Factor VIla, Factor IXa, Factor Xa, Factor Xla, Factor lia, proteína Ca y plasmina.

3. Método según una de las reivindicaciones precedentes, en donde el primero o segundo factor proteolítico de coagulación es trombina.

4. Método según una de las reivindicaciones precedentes, en donde el primero o segundo factor proteolítico de coagulación es Factor Xa.

5. Método según una de las reivindicaciones precedentes, en donde el primero o segundo sustrato cromogénico exhibe como cromóforo para-nitroanilina o ácido 5-amino-2-nitro-benzoico.

6. Método según una de las reivindicaciones precedentes, en donde el primero o segundo sustrato cromogénico exhibe como cromóforo un derivado de fenoxazim.

7. Método según una de las reivindicaciones 1 a 6, en donde mediante la inhibición del cambio de absorción, se determina la concentración de anticoagulante en la muestra.

8. Kit de prueba consistente en un primer reactivo con una concentración definida de un primer factor de coagulación proteolítico, y un segundo reactivo con una concentración definida de un segundo factor de coagulación proteolítico,

y

a. un tercer reactivo que contiene un primer sustrato cromogénico con especificidad por el primer factor de coagulación proteolítico y un segundo sustrato cromogénico con especificidad por el segundo factor de coagulación proteolítico; o

b. un tercer reactivo que contiene un primer sustrato cromogénico con especificidad por el primer factor de coagulación proteolítico y un cuarto reactivo que contiene un segundo sustrato cromogénico con especificidad por el segundo factor de coagulación proteolítico,

en donde el primer sustrato cromogénico exhibe un cromóforo, cuyo máximo de absorción se desvía por lo menos 100 nm del máximo de absorción del cromóforo del segundo sustrato cromogénicos.

9. Kit de prueba según la reivindicación 8, en donde el primer factor proteolítico de coagulación es trombina.

10. Kit de prueba según una de las reivindicaciones 8 o 9, en donde el segundo factor proteolítico de coagulación es Factor Xa.

11. Kit de prueba según una de las reivindicaciones 8 a 10, en donde el primer sustrato cromogénico con especificidad por el primer factor de coagulación proteolítico exhibe un cromóforo del grupo de para-nitroanilina y ácido 5-amino-2-nitro-benzoico y el segundo sustrato cromogénico con especificidad por el segundo factor de coagulación proteolítico exhibe un cromóforo del grupo de los derivados de fenoxazim, o al revés.