Método para detectar una infección con plasmodio.

Proceso para detectar una infección con plasmodio en una muestra de sangre del paciente el cual comprende los pasos de:

a) realizar un análisis diferencial de los granulocitos neutrófilos polimorfonucleares en la muestra y determinar la distribución del volumen celular y de la densidad celular;

b) determinar la cantidad de trombocitos en la muestra;

c) determinar la distribución de la densidad celular de los trombocitos en la muestra;

d) obtener parámetros demuestra a partir de las determinaciones realizadas en a) - c); y

e) evaluar los parámetros frente a un criterio predeterminado, en cuyo caso al cumplirse el criterio se encuentra presente una infección con plasmodio, en cuyo caso el criterio se establece con base en uno o varios parámetros de muestra y se determina con base en una comparación de muestras de sangre infectadas con los valores respectivos de las muestras de sangre normales.

Método para detectar una infección con plasmodio La invención se refiere a un método para detectar una infección con plasmodio en una muestra de sangre del paciente.

Las infecciones con plasmodio, como por ejemplo enfermedades de malaria provocadas por los gérmenes patógenos Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae así como Plasmodium knowlesi, son las causantes de cientos de millones de nuevas infecciones en todo el mundo cada año. Según las cuentas de la Organización Mundial de la Salud (OMS) se calcula un rango de 300 a 500 millones de personas infectadas anualmente.

Con respecto al desarrollo de resistencia creciente frente a los medicamentos existentes para tratar infecciones con plasmodio, existe por lo tanto una necesidad creciente de métodos confiables, económicos, capaces de realizarse rápidamente, que puedan excluir adicionalmente en gran medida los resultados falsos positivos y falsos negativos. Por ejemplo, en regiones con una baja prevalencia de infecciones de malaria serían necesarios métodos de diagnóstico altamente sensibles a fin de reconocer como tales a las pocas personas infectadas.

Por otra parte, en regiones del mundo con una alta prevalencia/incidencia, las cuales usualmente se cuentan entre las regiones más pobres del mundo, existe una demanda alta de ensayos de prueba con una especificidad alta a fin de excluir resultados falsos positivos (es decir, reconocer como sanas a las personas sanas) .

Por lo regular, también existe el problema de que no solamente tiene que investigarse un número extremadamente alto de muestras de paciente, sino que esto también tiene que efectuarse rápidamente, tal como se discutió previamente, porque los resultados del diagnóstico deben estar disponibles en el transcurso de menos de 2 horas. En el caso que esto no sea posible, el paciente tiene que tratarse posiblemente con base en una valoración clínica superficial.

Las consecuencias de un diagnóstico de malaria deficiente o falso negativo/falso positivo son variadas: en el caso de un diagnóstico falso positivo el empleo (sin sentido) de medicamentos puede provocar efectos secundarios que podrían evitarse, muy aparte de la carga financiera sobre el sistema de salud pública, así como de la posibilidad de una formación de resistencia al plasmodio. En un estudio del año 2006 se concluyó que un ensayo diagnóstico con una sensibilidad y especificidad respectivas de 95%, que solo necesitara infraestructura mínima, podría evitar más de 100, 000 casos letales y más de 400 millones de tratamientos innecesarios (Rafael ME, Taylor T, Magill A et al. Reducing the burden of childhood malaria in Africa: The role of improved diagnosis (Reducción de la carga de malaria infantil en Ã?frica: el papel del diagnóstico mejorado) . Nature. 2006; 444 (suppl 1) : 39 -48)

En la práctica, un problema principal resulta durante el diagnóstico de enfermedades por parásitos, por ejemplo malaria, cuando el diagnóstico de laboratorio se efectúa solamente cuando aparece una sospecha clínica de que el paciente realmente sufre de una infección de este tipo. En regiones con una prevalencia/incidencia baja, esto puede conducir principalmente a que las personas enfermas no sean tratadas o no sean tratadas a tiempo. Por ejemplo, en un estudio canadiense (Kain et al, 1998, Clinics in Infectious Diseases (La clínica en enfermedades infecciosas) 27, 142 -149) se reporta que inicialmente no se hizo el diagnóstico correcto para el 59% de todos los viajeros que regresaban infectados de malaria. Transcurrieron 7.6 días en promedio antes de hacerse el diagnóstico correcto y antes de comenzar la terapia para Plasmodium falciparum y 5.1 días para Plasmodium vivax. Retrasos de este tipo pueden conducir a complicaciones significativas y a una tasa de mortalidad elevada (Humare et al, 1997, Canadian Medical Association Journal 156, 1165 -1167) .

Para el diagnóstico de infecciones por plasmodio se encuentran disponibles varios métodos: el método más seguro consiste en un análisis microscópico de sangre, aunque este método es costoso en términos de personal, tiempo y aparatos. Con el método microscópico corriente, el personal técnico capacitado puede determinar de modo confiable el tipo y la etapa de la infección.

Además existen las llamadas pruebas diagnósticas rápidas (Rapid Diagnostic Test = RDT) . Por ejemplo, en este caso se usan anticuerpos monoclonales para la detección de antígenos de parásitos. Este ensayo se usa habitualmente para detectar infecciones por Plasmodium falciparum.

Un ensayo ostensiblemente más sensible para el diagnóstico de malaria consiste en la reacción en cadena de polimerasa, la cual, no obstante, es poco adecuada para casos agudos debido a los altos costes en términos de material y de tiempo.

Entre el grupo de los ensayos de diagnóstico rápido (Rapid Diagnostic Tests o RDT) también se cuentan métodos automatizados que debido a su alto rendimiento son adecuados de modo sobresaliente para métodos de detección

para una cobertura completa. Para esto, véase Hanscheid T, Pinto BG, Pereira I, Christino JM, Valadas E (1999) Avoiding misdiagnosis of malaria: a novel automated method allows specific diagnosis, even in the absence of clinical suspicion. Emerging Infectious diseases (Evitar diagnósticos equivocados de malaria: un método automatizado novedoso permite diagnósticos específicos incluso en ausencia de sospecha clínica) [1999, 5 (6) : 836838].

Para la aplicación automatizada, con éxito creciente se aplican los llamados "automated cell counters" (contadores automatizados de células) . Ejemplos de estos son los aparatos Advia 2120, Sysmex XE-2100 así como CellaVision DM96. Aparte de su alta tasa de rendimiento, estos aparatos automatizados proporcionan algunas ventajas como, por ejemplo, alta objetividad (sin variabilidad dependiendo del observador) , eliminación de variaciones estadísticas que están ligadas usualmente con un conteo manual (conteo de altas cantidades de células) , así como la determinación de numerosos parámetros que no estarían disponibles en el caso de un conteo manual y, tal como se indicó, un manejo más eficiente y más efectivo en costes. Algunos de estos aparatos pueden procesar 120 a 150 muestras de pacientes por hora.

Los principios técnicos del conteo celular individual automatizado se basan ya sea en una medición de impedancia (resistencia) o bien en un sistema óptico (medición de luz dispersa o de absorción) .

En el caso de métodos de impedancia, el conteo de células así como su determinación de magnitud se efectúan con base en la detección y la medición de las modificaciones de la conductividad eléctrica (resistencia) , la cual es causada por una partícula que se mueve a través de una pequeña abertura. Las mismas partículas, por ejemplo células sanguíneas, no conducen electricidad aunque sin embargo se suspenden en un medio de dilución que conduce electricidad. Si una suspensión de células de este tipo se hace pasar por una abertura, la impedancia (resistencia) del conducto eléctrico entre los dos electrodos que se encuentran a cada lado de la abertura, aumenta temporalmente con el paso de una célula individual.

Por ejemplo, en la WO 2005/088301 se describe un método para detectar malaria y otras infecciones por parásitos por medio de una medición de impedancia de este tipo (véase la parte experimental) , también en el artículo "Development of an Automated Malaria Discriminant Factor Using VCS Technology" (Desarrollo de un factor discriminante automatizado de malaria usando tecnología VCS) , Briggs C et al. Am J Clin Pathol 2006.

En contraste con el método de impedancia, el método óptico comprende la conducción de un rayo de láser a través de una muestra de sangre diluida la cual se detecta por el rayo láser en una corriente continua. Cada célula que pasa por la zona de detección de la célula de paso dispersa la luz enfocada. La luz dispersa se detecta entonces por medio de un fotodetector y se convierte en un impulso eléctrico. La cantidad de impulsos generada aquí es directamente proporcional al número de células que pasa por la zona de detección en un lapso especial de tiempo.

En el caso de métodos ópticos, la dispersión de luz de las células individuales que pasan por la zona de detección se mide en ángulos diferentes. De esta manera se registran informaciones sobre la estructura celular, la forma y la capacidad de reflexión. Estas propiedades pueden usarse para diferenciar entre los diferentes tipos de células sanguíneas y para usar los parámetros derivados y para el diagnóstico de las desviaciones de las células sanguíneas de la norma.

Los valores logrados mediante... [Seguir leyendo]

1. Proceso para detectar una infección con plasmodio en una muestra de sangre del paciente el cual comprende los pasos de:

a) realizar un análisis diferencial de los granulocitos neutrófilos polimorfonucleares en la muestra y determinar la distribución del volumen celular y de la densidad celular;

b) determinar la cantidad de trombocitos en la muestra;

c) determinar la distribución de la densidad celular de los trombocitos en la muestra;

d) obtener parámetros demuestra a partir de las determinaciones realizadas en a) -c) ; y e) evaluar los parámetros frente a un criterio predeterminado, en cuyo caso al cumplirse el criterio se encuentra presente una infección con plasmodio, en cuyo caso el criterio se establece con base en uno o varios parámetros de muestra y se determina con base en una comparación de muestras de sangre infectadas con los valores respectivos de las muestras de sangre normales.

2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la determinación de los parámetros se efectúa por medio de medición de luz dispersa.

3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el cual la infección con plasmodio es una infección con Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae o Plasmodium knowlesi.

4. Proceso de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el cual se efectúa adicionalmente una esferización y análisis diferencial de los reticulocitos y eritrocitos mediante medición de luz dispersa y medición de absorción.

5. Proceso de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el cual adicionalmente después de una tintura de todos los leucocitos en la muestra se efectúa un análisis diferencial por medio de medición de luz dispersa y absorción.

6. Proceso de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual la tintura se realiza por medio de 4-cloro-1-naftol como sustrato.

7. Proceso de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el cual adicionalmente después de una tintura se efectúa la determinación de la distribución de volumen de los granulocitos neutrófilos.

8. Proceso de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el cual adicionalmente como parámetro se usa la desviación estándar de la distribución de volumen y la distribución de absorción de todos los leucocitos después de tinturar.

9. Proceso de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el cual la determinación en a) se efectúa después de lisar al menos los leucocitos eosinófilos y neutrófilos, aunque no los basófilos, por medio de un reactivo de lisis adecuado.

10. Proceso de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el cual después de una lisis específica de todas las células, excepto los leucocitos basófilos, se determina la porción no específica a partir del diagrama de luz dispersa (dispersión de ángulo pequeño y de ángulo grande) .

11. Proceso de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones precedentes, en el cual los valores bajos de los parámetros determinados en a) , b) y c) son predictivos de la presencia de una infección con plasmodio.

12. Proceso de acuerdo con la reivindicación 7, 8 y 10, en el cual un incremento de los parámetros es predictivo de la presencia de una infección con plasmodio.

13. Proceso de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones precedentes, el cual se realiza con un aparato automatizado de conteo de células.