Extracto de plaquetas inactivado viral, uso y preparación del mismo.

Un método para eliminar disolvente-detergente (D/D) de una mezcla líquida biológica o preparación líquida biológica por cromatografía de interacción hidrófoba (HIC),

que comprende las etapas de:

proporcionar la mezcla líquida biológica o preparación; y

cargar la mezcla o preparación a HIC, y recoger un material eluido bajo condiciones no isocráticas.

CAMPO DE LA INVENCiÓN

La invención se refiere a extracto de plaquetas inactivado viral derivado de múltiples donantes; a su preparación y uso.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

Las plaquetas son pequeñas células anucleadas de forma irregular que desempeñan una función fundamental en la hemostasia y curación. Las plaquetas contienen una matriz completa de proteinas pre-sintetizadas, entre las que están proteinas de señalización, proteínas citoesqueléticas, proteinas de la membrana y proteinas reguladoras. Participan en etapas clave de la regeneración de tejido y procesos de curación en el sitio de lesión, principalmente debido al contenido de gránulos de plaquetas que comprenden una multitud de moléculas bioactivas que incluyen factores de crecimiento (GF) , citocinas y quimiocinas. Los GF de plaquetas tales como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , el factor de crecimiento transformante (TGF) , factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) , factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y otros son piezas clave en todas las siguientes fases de la cascada de cicatrización: fase inflamatoria, proliferativa y de remodelaciÓn.

Estudios han mostrado que los GF derivados de plaquetas estimulan la angiogénesis, mitogénesis, proliferación celular, neutrófilos y macrófagos, sintesis de colágeno, contracción de heridas, sintesis de matriz extracelular, epitelialización y quimiotaxia.

Las plaquetas se usan rutinariamente por la transfusión, por ejemplo, para mejorar la hemostasia. Recientemente, las plaquetas se están usando cada vez más en forma de plasma rico en plaquetas (PRP) , también denominado gel de PRP, gel de plaquetas, coágulo de PRP, etc. Normalmente, el PRP es una preparación ex vivo que consiste en plaquetas autólogas concentradas en un volumen limitado de plasma (Lacei KM, Dardik A. Platelet-rich plasma: soporte for its use in wound healing. Yale J Biol Med. 2010 Mar;83 (1) :1-9) .

Para administración tópica, el PRP se activa normalmente mediante la adición de trombina y{o CaCi2 produciendo la formación de gel de fibrina por la interacción entre trombina (endógena o exógena) y fibrinógeno. Tras la activación, las plaquetas experimentan desgranulación activa y liberan diversos mediadores que incluyen GF (Lacci KM, Dardik A, 2010) . El uso de PRP para inyección comprende actualmente un segmento pequeño pero rápidamente en crecimiento en el mercado. La exposición razonada pa ra usar PRP en el aumento de tejido blando y duro es su potencial para potenciar la regeneración de tejido en lesiones que no se curan, aceleran la maduración, vascularización y epitelialización de las heridas, disminuir la formación de cicatrices y reducir las complicaciones posoperatorias y morbilidad (Lacci KM, Dardik A, 2010) .

Estudios usando PRP activado junto con diversos tipos de células han mostrado que faclores, por ejemplo, factores de crecimiento liberados de PRP pueden inducir proliferación celular [ (por ejemplo, Platelet-rich plasma enhances human osteoblast-like cell proliferation and differentiation. J Oral Maxillofac Surg. 2005 Mar;63 (3) :362-9; BertrandDuchesne et al. Epidermal growth factor released from platelet-rich plasma promotes endothelial cell proliferation in vitro. J Periodontal Res. 2010 Feb;45 (1 ) :87-93; Kakudo et al. Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts. Plast Reconstr Surg. 2008 Nov;122 (5) :1352-60) , modular la capacidad angiogénica de las células endoteliales humanas (Sulpice et al. Cross-talk between the VEGFA and HGF signalling pathways in endothelial cells. Biol Cel!. 2009 Sep;101 (9) :525-39; Rughelli et al. Platelet gelreleased supematant modulates the angiogenic capability of human endothelial cells. Blood Transfus. 2008 Jay;6 (1 ) :12-7) e inducir propiedades osteo-inductivas (Intini G. The use of platelet-rich plasma in bone reconstruction therapy. Biomaterials. 2009 Oct;30 (28) :4956-66) ]. Además, se encontró que PRP activado soportaba el crecimiento celular in vitro y mantenia la viabilidad de varias células diana que incluyen mielomas, hibridomas, hepatocitos, fibroblastos y células epiteliales, a un nivel comparable o superior al nivel soportado por el suero bovino fetal (Johansson et al. Platelet Iysate: a replacement for fetal bovine serum in animal cell culture? Cylotechnology. 2003 Jul;42 (2) :67-74) .

PRP Y los factores de crecimiento liberados se usan actualmente en diversos procedimientos de regeneración de tejido quirúrgico, predominantemente en cirugia ortopédica y dental (Nurden el al. Platelets and wound healing. Front Biosci. 2008 May 1;13:3532-48) . En cirugía ortopédica se usa PRP principalmente para artroplastia de la rodilla, fusión espinal lumbar y en degeneración de discos intervertebrales (revisado en Nurden et al, 2008) . Las aplicaciones de PRP en odontologia y cirugia maxilofacial incluyen principalmente consolidación de implantes de titanio, aumento del seno maxilar y remodelación ósea (revisado en Nurden el al, 2008) . También se usa PRP cada vez más para la reparación de tendón y ligamento, cirugía plástica y reconstructiva facial, cicatrización crónica de la piel, oftalmologia, regeneración de nervios faciales, además de en cirugia cardiaca y bariátrica (revisado en Nurden et al, 2008) .

Sin embargo, una desventaja importante en el presente uso de PRP autólogo y factores liberados reside en la falta de normalización. Digno de mención, están comercialmente disponibles diferentes sistemas manuales, semiautomatizados y completamente automatizados para la preparación de PRP que se diferencian en parámetros tales como el tiempo de preparación, rendimiento de las plaquetas y eficiencia de recogida (Mazzucco et al. Not ever y PRP-gel is born equal. Evaluation of growth factor availability for tissues through four PRP-gel preparations: Fibrinet, RegenPRP-Kit, Plateltex and one manual procedure. Vox Sango 2009 Aug;97 (2) :110-8) .

Otra variable importante es la técnica usada para la activación de plaquetas [trombina autóloga, heteróloga o recombinante, cloruro de calcio o batroxobina (Rozman P, Bolta Z. Use of platelet growth factors in treating wounds and soft-tissue injuries. Acta Dennatovenerol Alp Panonica Adriat. 2007 Dec;16 (4) :156-65) ], que puede afectar la eficiencia de la liberación de gránulos y la cantidad de GF secretados (Rozman P, Bolta Z, 2007) . Además, como las plaquetas son muy sensibles al estrés mecánico y cambios en el entorno circundante, pueden activarse y los GF pueden liberarse durante el procesamiento, antes de la etapa de activación prevista (Mazzucco et al, 2009) . Esta activación incontrolada puede aumentar adicionalmente la variabilidad en la composición del producto final si se usan diferentes sistemas de preparación de PRP. Adicionalmente, una debilidad inherente importante de la preparación de PRP autólogo es que el contenido de GF de plaquetas varia entre individuos y, por tanto, puede conducir a resultados inferiores a los óptimos. Finalmente, la carga financiera de la maquinaria dedicada, kits de procesamiento de PRP disponibles y la necesidad de personal cualificado deben tenerse en consideración cuando se trabaja con PRP aut6logo.

Una publicación reciente (Su et al. "A virally inactivated functional growth factor preparation from human platelet concentrates". Vox Sango 2009 Aug;97 (2) :119-128) desvela la preparación de un extracto de factor de crecimiento funcional coagulable derivado de donaciones de mezclas de plaquetas de aféresis. Sin embargo, la preparación coagulable desvelada tiene la desventaja de que incluye solo una etapa de inactivación viral, es decir, inactivación viral con disolvente I detergente (DID) que es particularmente eficaz contra virus envueltos, pero no contra virus no envueltos. La publicación indica la posibilidad de aplicar nanofiltración como segunda etapa de inactivación viral. Esta preparación también contiene impurezas de proteínas del plasma y de leucocitos. La etapa de eliminación de DIO por cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) reduce en gran parte el PDGF en la preparación. Además, el potencial de coagulabilidad de la preparación puede limitar su uso a la aplicación local o prevenir su uso sistémico.

Bumouf et al. ("A novel viraUy inactivated human platelet Iysate preparation rich in TGF-beta, EGF and IGF, and depleted of PDGF and VEGF". Biotechnol Appl Biochem. 2010 Aug 6;56 (4) :151-60) desvela un lisado de plaquetas tratado con DIO con un contenido normalizado de TGF-beta, EGF y IGF Y agotado en PDGF y VEGF. La publicación desvela un método para la preparación de este lisado evitando la eliminación de DIO por cromatografía de interacción hidrófoba.

1. Un método para eliminar disolvente-detergente (DIO) de una mezcla líquida biológica o preparación liquida biológica por cromatografía de interacción hidrófoba (HIG) , que comprende las etapas de:

proporcionar la mezcla liquida biológica o preparación; y cargar la mezcla o preparación a HIG, y recoger un material eluido bajo condiciones no isocráticas.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la preparación líquida biológica es una preparación derivada de plaquetas.

3. El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que:

i) la HIC comprende las etapas de: cargar la preparación en HIC; lavar la HIG con una disolución isocrática; recoger el material sin unir; lavar la HIC con una disolución no isocrática; y recoger el material eluido; y/o ii) la disolución isocrática consiste en tampón de acetato-glicina y albúmina de suero humano; y en el que la disolución no isocrática comprende un disolvente orgánico y/o una molécula que puede unirse a factores derivados de plaquetas.

4. Un método para preparar un extracto de plaquetas seguro de virus, comprendiendo el método al menos dos tratamientos de inactivación viral ortogonal y que comprende las siguientes etapas:

proporcionar una fracción enriquecida en plaquetas de múltiples donantes; preparar un lisado de plaquetas; llevar a cabo un tratamiento de inactivación viral con disolvente I detergente (DIO) ; eliminar el DIO por cromatografia de interacción hidrófoba (HIC) usando un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la HIC comprende las etapas de: cargar el lisado en HIC y recoger un material eluido bajo condiciones no isocráticas; y realizar un segundo tratamiento de inactivación viral ortogonal.

5. El método según la reivindicación 4, en el que:

(i) la preparación dellisado de plaquetas se lleva a cabo durante el tratamiento con DIO de inactivación viral; y/o

(ii) durante el tratamiento de inactivación viral con DIO se lleva a cabo una subetapa de reducción de agregados; ylo

(iii) la reducción de agregados se lleva a cabo por fillración.

6. El método según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, que comprende además poner en contacto ellisado con una molécula que puede unirse a factores derivados de plaquetas antes de la eliminación de DIO.

7. El método según la reivindicación 3 o la reivindicación 6, en el que la molécula es un polianión, por ejemplo, un polianión seleccionado del grupo que consiste en heparina, sulfato de dextrano y combinación de los mismos.

8. El método segun una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que

(i) el segundo tratamiento de inactivación viral ortogonal comprende inactivación térmica; ylo

(ii) la fracción enriquecida en plaquetas es una fracción de plaquetas lavadas y/o reducidas en leucocitos de mezclas de aféresis de múltiples donantes; y/o

(iii) el método comprende además liofilizar el extracto.

9. Una preparación o mezcla segura de virus, obtenible según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1

, 3.

10. Una preparación o mezcla segura de virus según la reivindicación 9, que es un extracto de plaquetas, obtenible segun el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

11. Un extracto según la reivindicación 10 para su uso en la curación de tejido; reconstrucción de órganos; regeneración de tejido ylo tratamiento de inflamación.

12. El extracto según la reivindicación 11 para su uso según la reivindicación 11, en el que dicho uso comprende administrar el extracto con un agente de administración.

13. Un kit que comprende un receptor que contiene un extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que comprende además un agente de administración.

14. El kit según la reivindicación 13, en el que el agente de administración está hecho de material natural y/o sintético seleccionado del grupo que consiste en polimeros, hidrogeles, poli (alcohol vinflico) , polietilenglicol, ácido

hialurónico, sulfato de condroitina, gelatina, alginato, matrices de colágeno, carboximetilcelulosa, dextrano, poli (2hidroxietilmetacrilato) , agar, oxidar la celulosa generada, péptidos auto-ensamblados, ácido poli (glicólico) , ácido poli (láctico) , fibrina y combinaciones de los mismos.