Evento de maíz MIR604.

Un método para caracterizar una planta de raíz, o una parte de la misma,

que comprende un inserto heterólogo que comprende un gen cry3A055 de SEC ID NO: 59 flanqueado por secuencias nucleotídicas expuestas en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 2, y SEC ID NO: 4, respectivamente, o por sus complementos, que comprende digerir el ADN genómico de la planta con la endonucleasa de restricción KpnI y sondar el ADN digerido con una sonda que comprende al menos una molécula de ácido nucleico de longitud suficiente de nucleótidos contiguos homólogos o complementarios a una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 4, que funciona como una sonda de ADN específica para dicho ADN.

Evento de maiz MIR64

La presente invención se refiere generalmente al campo de biología molecular de plantas, transformación de plantas, y reproducción de plantas. Más específicamente, la invención se refiere métodos para caracterizar plantas de maíz transgénicas resistentes a insectos que comprenden un nuevo genotipo transgénico.

Las plagas de plantas son un factor importante en la pérdida de los cultivos agrícolas importantes del mundo. Alrededor de $8. millones de dólares se pierden cada año en los Estados Unidos solo debido a infestaciones de plagas no mamíferas que incluyen insectos. Las especies de gusanos de raíz de maíz se consideran las plagas de maíz más destructivas. Especies de plagas de gusanos de raíz importantes incluyen Diabrotica virgifera virgifera, el gusano de raíz de maíz del oeste; D. longicornis barberi, el gusano de raíz de maíz del norte, D. undedmpunctata howardi, el gusano de raíz de maíz del sur, y D. virgifera zeae, el gusano de raíz de maíz mejicano.

El gusano de raíz de maíz se controla principalmente por aplicaciones intensivas de plaguicidas químicos. Así se puede lograr un buen control del gusano de raíz de maíz, pero estas sustancias químicas algunas veces también pueden afectar organismos beneficiosos. Otro problema que resulta del amplio uso de plaguicidas químicos es la aparición de variedades resistentes de insectos. Esto se ha mejorado parcialmente mediante varias prácticas de manejo de la resistencia, pero existe una necesidad en aumento de estrategias de control de plagas alternativas. Una de tales alternativas incluye la expresión de genes externos que codifican proteínas insecticidas en plantas transgénicas. Este enfoque ha proporcionado un medio eficiente de protección contra plagas de insectos seleccionadas, y se han comercializado plantas transgénicas que expresan toxinas insecticidas, permitiendo a los granjeros reducir las aplicaciones de insecticidas químicos.

La expresión de genes externos en plantas puede ser influenciada por sus posiciones cromosómicas, posiblemente debido a la estructura de cromatina o a la contigüidad de elementos de regulación transcripcional cercanos al sitio de integración (véase, por ejemplo, Weising etal., 1988, "Foreign Genes in Plants", Ann. Rev. Genet. 22:421-477). Por lo tanto, es habitual producir cientos de eventos diferentes e identificar aquellos eventos en busca de un único evento que tenga niveles y patrones de expresión transgénica deseados para fines comerciales. Un evento que tiene niveles o patrones deseados de expresión transgénica es útil para la introgresión del transgén en otros antecedentes genéticos por cruzamiento sexual usando métodos de reproducción convencionales. La progenie de tales cruzamientos mantienen las características de expresión transgénica del transformante original. Esta estrategia se usa para asegurar la expresión génica fiable en un número de variedades que están bien adaptadas a condiciones de crecimiento local.

Sería ventajoso poder detectar la presencia de un evento particular con el propósito de determinar si la progenie de un cruzamiento sexual contiene un transgén de interés. Además, un método para la detección de un evento particular podría ser práctico para cumplir con normativas que requieren la aprobación de pre-mercado y el etiquetado de alimentos derivados de plantas de maíz recombinantes, por ejemplo. Es posible detectarla presencia de un transgén mediante cualquier método de detección de ácido nucleico bien conocido que incluye pero no se limita a amplificación térmica (reacción en cadena de la polimerasa (PCR)) usando cebadores polinucleotídicos o hibridación de ADN usando sondas de ácido nucleico. Típicamente, por cuestión de simplicidad y uniformidad de reactivos y metodologías para uso en la detección de un constructo de ADN particular que se ha usado para transformar diversas variedades de plantas, estos métodos de detección generalmente se centran en elementos genéticos usados frecuentemente, por ejemplo promotores, terminadores, y genes marcadores, porque para muchos constructos de ADN, la región de secuencia codificante es intercambiable. Como resultado, tales métodos pueden no ser útiles para discriminar entre constructos que difieren solamente con referencia a la secuencia codificante. Además, tales métodos pueden no ser útiles para discriminar entre eventos diferentes, particularmente aquellos producidos usando el mismo constructo de ADN a menos que la secuencia de ADN cromosómico adyacente al ADN heterólogo insertado ("ADN flanqueante") sea conocida.

El documento WO 3/5273 describe un evento de maíz transgénico nuevo denominado VIP134 que comprende un nuevo genotipo transgénico que comprende un gen vip3A y un gen pat que confiere resistencia a insectos y tolerancia a herbicidas, respectivamente, al evento de maíz transgénico y su progenie.

Se describen además ensayos para detectar la presencia del evento VIP134 en base a las secuencias de ADN de los constructos recombinantes insertados en el genoma de maíz que dan como resultado el evento VIP134, y de secuencias genómicas que flanquean los sitios de inserción.

El documento WO 24/1161 describe composiciones y métodos para detectar la presencia del ADN del evento de maíz MON863 insertado en el genoma de maíz procedente de la transformación del constructo recombinante que contiene un gen Cry3Bb y de secuencias genómicas que flanquean el sitio de inserción. Se describen además plantas del evento de maíz MON863, su progenie y semillas que contienen el ADN del evento de maíz MON863.

El documento EP 1167531 describe un constructo de ADN que confiere tolerancia a plantas de maíz transgénicas. También se describen ensayos para detectar la presencia del evento de maíz PV-ZMGT32(nk63) en base a la

secuencia de ADN del constructo recombinante insertado en el genoma de maíz y de secuencias genómicas que flanquean el sitio de inserción.

El documento US 2212582 describe plantas de maíz que incluyen el evento MON81, que confiere resistencia al daño por insecto lepidóptero. También se describen ensayos para detectar la presencia del evento MON81 en base a la secuencia de ADN del constructo recombinante insertado en el genoma de maíz que da como resultado el evento MON81, y las secuencias genómicas que flanquean el sitio de inserción.

La presente invención incluye métodos para caracterizar un evento de maíz transgénico resistente a Insectos que ha incorporado en su genoma un gen cry3A55, descrito en la Publicación Internacional n°WO 3/1.881, publicada el 6 de marzo de 23, que codifica una toxina insecticida Cry3A55, útil para controlar de plagas de insectos Diabrotica spp. El evento de maíz transgénico también ha incorporado en su genoma un gen pmi, que codifica una enzima de fosfomanosa isomerasa (PMI), descrita en la Patente US n° 5.767.378, útil como un marcador seleccionable, que permite a la planta utilizar mañosa como una fuente de carbono. Se describen además aquí secuencias de ácido nucleico aisladas novedosas las cuales son únicas para el evento de maíz transgénico, útiles para identificar el evento de maíz transgénico y para detectar ácidos nucleicos del evento de maíz transgénico en una muestra biológica, además de kits que comprenden los reactivos necesarios para uso en la detección de estos ácidos nucleicos en una muestra biológica.

La presente invención se refiere a un método para caracterizar una planta de maíz, o una parte de la misma, que comprende un inserto heterólogo que comprende un gen c/y3A55 de SEC ID NO: 59 flanqueado por secuencias nucleotídicas expuestas en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 2, y SEC ID NO: 4, respectivamente, o por sus complementos, que comprende digerir el ADN genómico de la planta con la endonucleasa de restricción Kpn\ y sondar el ADN digerido con una sonda que comprende al menos una molécula de ácido nucleico de longitud suficiente de nucleótidos contiguos homólogos o complementarios a una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 4, que funciona como una sonda de ADN específica para dicho ADN. En una realización, se usa una sonda que comprende la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 56 o SEC ID NO: 59. En una realización, la invención se refiere al método para caracterizar una planta de maíz como se define anteriormente, en el que dicha planta de maíz comprende además en el inserto heterólogo la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 62.

En particular, la invención se refiere al método para caracterizar una planta de maíz como se define anteriormente, en el que dicha planta de maíz comprende en el inserto... [Seguir leyendo]

1. Un método para caracterizar una planta de raíz, o una parte de la misma, que comprende un inserto heterólogo que comprende un gen cry3A55 de SEC ID NO: 59 flanqueado por secuencias nucleotídicas expuestas en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 2, y SEC ID NO: 4, respectivamente, o por sus complementos, que comprende digerir el ADN genómico de la planta con la endonucleasa de restricción Kpn\ y sondar el ADN digerido con una sonda que comprende al menos una molécula de ácido nucleico de longitud suficiente de nucleótidos contiguos homólogos o complementarios a una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 4, que funciona como una sonda de ADN específica para dicho ADN.

2. El método de la reivindicación 2, en el que dicha sonda comprende la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 56 o SEC ID NO: 59.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dicha planta de maíz comprende además dentro del inserto heterólogo la secuencia nucleotídica como se expone en SEC ID NO: 62.

4. El método de la reivindicación 1, en el que dicha planta de maíz comprende dentro del inserto heterólogo las secuencias nucleotídicas como se exponen en SEC ID NOs: 57-63.

5. El método de la reivindicación 1, en el que dicha planta de maíz es una semilla de una planta de maíz según la reivindicación 1, que comprende el inserto heterólogo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 ó 5.

6. El método de la reivindicación 5, en el que dicha semilla es una semilla tratada con sustancias químicas para tratamiento de semillas.

7. El método de la reivindicación 5, en el que dicha semilla es una semilla híbrida.

8. Un método para detectar la presencia de un ADN que corresponde a una planta de maíz que comprende un inserto heterólogo que comprende un gen cry3A55 de SEC ID NO: 59 flanqueado por secuencias nucleotídicas expuestas en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 2, y SEC ID NO: 4, respectivamente, o por sus complementos, en una muestra, que comprende

a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con una sonda que se híbrida en condiciones muy restrictivas con ADN genómico procedente de una planta de maíz que comprende un Inserto heterólogo que comprende un gen cry3A55 de SEC ID NO: 59 flanqueado por secuencias nucleotídicas expuestas en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 2, y SEC ID NO: 4, respectivamente, o por sus complementos, y que no se híbrida en condiciones muy restrictivas con ADN de una planta de maíz de control;

b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación muy restrictivas; y

c) detectar la hibridación de la sonda al ADN;

en el que dicha sonda comprende al menos una molécula de ácido nucleico de longitud suficiente de nucleótidos contiguos homólogos o complementarios a una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 4.

9. Un kit para la detección de un ADN que corresponde a una planta de maíz que comprende un Inserto heterólogo que comprende un gen cry3A55 de SEC ID NO: 59 flanqueado por secuencias nucleotídicas expuestas en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 2, y SEC ID NO: 4, respectivamente, o por sus complementos, en una muestra biológica, en el que el kit comprende al menos una molécula de ácido nucleico de longitud suficiente de nucleótidos contiguos homólogos o complementarios a una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 4, que funciona como una sonda de ADN específica para dicho ADN.