Reactivos de inmunoanálisis y procedimientos de uso de los mismos.

Un procedimiento de detección de dos o más antígenos en una muestra,

que comprende:

(i) poner en contacto simultáneamente una muestra, que previamente se ha puesto en contacto simultáneamente con un cóctel de anticuerpos primarios que comprende al menos un primer anticuerpo primario y al menos un segundo anticuerpo primario en una disolución acuosa tamponada para el cóctel de anticuerpos primarios, con una composición que comprende al menos un primer anticuerpo secundario y al menos un segundo anticuerpo secundario para formar al menos dos complejos de antígeno-anticuerpo en la muestra, en el que el al menos un primer anticuerpo secundario se acopla con un resto de poli(fosfatasa alcalina) (poli-ALP) y el al menos un segundo anticuerpo secundario se acopla con un resto de poli(peroxidasa de rábano picante) (poli-HRP), y en el que la composición comprende un tampón para el primer y segundo anticuerpos secundarios; y

(ii) detectar los al menos dos complejos de antígeno-anticuerpo en la muestra.

Reactivos de inmunoanálisis y procedimientos de uso de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la detección de antígenos en una muestra usando reactivos de 1 anticuerpos.

DESCRIPCIÓN DE LOS ANTECEDENTES

El campo de la inmunoquímlca en evolución ha conducido a protocolos simplificados con tiempos de 15 incubación más cortos y automatización. La capacidad de teñir dos o más anticuerpos en una sección de tejido también ha evolucionado.

Así, Suzuki y col. (2) Differentiation 66:16-115 describen un procedimiento de detección de antígenos inmunoquímico múltiple simultáneo de dos capas, en el que los anticuerpos secundarios están conjugados 2 con fluoróforos. Tsurui y col. (2) J. Histochem. Cytochem. 48:653-662 describen un procedimiento de detección de antígenos inmunoquímico múltiple simultáneo de una capa o dos capas, en el que los marcadores detectables son fluoróforos. Masón y col. (2) J. Pathol. 191:452-461 describen un procedimiento de detección de antígenos inmunoquímico múltiple simultáneo de dos capas, en el que los anticuerpos secundarios están conjugados con fluoróforos. Van Noorden (22) Folia Histochemica 25 Cytobiologica 4:121-124 describe procedimientos de detección de antígenos inmunoquímicos múltiples simultáneo de dos capas. Van Noorden y col. (23) Biomedical Scientist 88-811 describen un procedimiento de detección de antígenos inmunoquímico múltiple secuencial de tres capas. La solicitud de patente de EE.UU. n° 22/17353 describe un procedimiento de detección de antígenos inmunoquímico múltiple secuencial de una capa, en el que los antígeno-anticuerpos específicos están conjugados a un 3 marcador enzlmátlco. Shi y col. (1999) Applied Immunohistochem. Mol. Morphol. 7:21-28, describen un procedimiento de detección de antígeno único inmunoquímico de dos capas (véase la página 23, columna derecha).

Un ensayo de tinción doble o triple sería mucho más práctico tanto para el patólogo como para el 35 histotecnólogo, reduciendo el error, reduciendo los reactivos, reduciendo la cantidad de tejido necesaria, y lo que es más importante el tiempo. Además, esta tecnología conduce a un procedimiento más práctico para que un patólogo haga un diagnóstico con anticuerpos que tienen que ser teñidos al unísono, así como en situaciones donde el tejido está limitado.

En el pasado, las tinciones dobles o triples se llevaban a cabo principalmente en el marco de la investigación. Sin embargo, los procedimientos de tinción dobles y triples previos requerían personal entrenado, eran técnicamente difíciles, consumían tiempo, y en la mayoría de los casos no se usaban en un sistema de inmunotinción automático. Por lo tanto, el uso de técnicas de tinción doble o triple no se usa a menudo en el

marco clínico.

Previamente se usó un sistema típico de 3 etapas de avidina-biotina de peroxidasa de rábano picante (HRP) para la primera secuencia de anticuerpo, seguido de una etapa de elución (desnaturalización) y después una segunda secuencia de anticuerpo con un sistema de fosfatasa alcalina (AP). Esto produce un precipitado de color marrón (DAB) y rojo (Fast Red) para cada antígeno, produciendo así una tinción doble. Si el tejido 5 contenía biotina endógena, era necesaria una etapa de avidina-biotina. Una tinción doble podría requerir de 3 a 4 etapas y una tinción triple podría requerir de 4 a 5 etapas, dependiendo de la complejidad del ensayo. La mayoría de los dispositivos de tinción inmunohistoquímica automáticos no estaban diseñados para hacer estos ensayos de tinción doble complicados. También requería un técnico altamente capacitado para valorar adecuadamente cada secuencia de anticuerpos.

Recientemente se han introducido kits de detección poliméricos sin biotina tanto para el sistema de detección de HRP como de AP (DakoCytomation; Zymed Laboratories). Estos kits eliminan las etapas de bloqueo de avidina-biotina y requieren una etapa para la detección frente a dos. Sin embargo, dependiendo del dispositivo de inmunotinción y el número de lavados requeridos, estos kits todavía requieren una experiencia

técnica significativa y la programación de la tinción IHC no está adecuadamente diseñada para las tinciones dobles y en especial las tinciones triples. También se ha descrito la falta de sensibilidad con antígenos nucleares con este tipo de kit pollmérlco. Esta nueva tecnología ha sido popular en el campo de la Investigación, pero no se ha usado mucho en el marco clínico, debido a estas dificultades.

El uso de cócteles de anticuerpos se ha usado en el marco clínico durante una serie de años. LCA, AE1/AE3, CMV, y más recientemente, CD15, Pan Melanoma (HMB45 + MART-1 + Tiroslnasa) y PIN-4 (P54S + HMWCK + p63) son varios cócteles que se han usado de forma rutinaria en el marco clínico. También se han usado kits de detección universales tanto dirigidos contra ratón como dirigidos contra conejo desde finales de 1 los 8.

También se ha usado durante muchos años la tecnología de tinción doble y triple usando inmunohistoquímica en tejidos fijados en formallna y embebidos en paraflna. Las tinciones dobles se llevan a cabo aplicando anticuerpos primarios y detección en una secuencia de etapas para lograr el mareaje múltiple en el mismo 15 tejido. Diferentes procedimientos usados para la detección Incluyen procedimientos de fluorescencia, ¡nmunoperoxldasa, Inmuno-oro y procedimientos ¡n sltu.

En vista de lo anterior, se han hecho evidentes las desventajas de la tecnología de tinción doble previa. Es Ilustrativo de estas desventajas el procedimiento típico de la tecnología previa para llevar a cabo un 2 inmunoensayo de tinción doble. Por ejemplo, la muestra se trata con peróxido de hidrógeno durante 5 min, seguido de bloqueo con dos proteínas opcionales (de 5 a 1 min) y bloqueo con avldlna-biotina (de 2 a 4 min). Después, se aplica el anticuerpo primario durante 3 a 6 min, se une durante 1 a 2 min, se marca, p. ej., con HRP durante 1 a 2 min, se trata con DAB durante 5 min, y después se desnaturaliza durante 5 min. Posteriormente, se aplica el segundo anticuerpo primario durante 3 a 6 min, seguido de un bloqueo de 25 proteína opcional de 5 a 1 min, unión durante 1 a 2 min, y después mareaje del segundo anticuerpo primario, por ejemplo, con AP, durante 1 a 2 min. La reactividad se detecta aplicando Fast Red durante 1 a 2 min seguido de contratinción (más azulado) durante 3 y 6 segundos y se aplica cubreobjetos, lo cual requiere un medio de montaje basado en agua. El tiempo total para este procedimiento de tinción doble es aproximadamente de 3 a 4 horas con un total de 11-15 etapas manuales; más de 12 a 14 lavados (32 etapas 3 máximo). Además, para una tinción triple habría que añadir 5 etapas más (4+ etapas máximo) y requerirla un tiempo total de 4 a 5 horas.

En general, a pesar de que se conoce la dilución de anticuerpos en un tampón y el almacenamiento de anticuerpos, esas diluciones típicamente se llevaban a cabo en disolución salina tamponada con fosfato y 35 otra disolución isotónica y también puede tener cantidades pequeñas de albúmina de suero bovino y en algunos casos, cantidades relativamente pequeñas de detergentes tales como Tritón X-1 o NP-4 (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lañe, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y., 1988; y Current Protocols in Molecular Biology, Ausebel y col (eds.), John Wiley and Sons, Inc. N.Y., 21). Sin embargo, la combinación de reactivos en un cóctel de anticuerpos primarios no se ha 4 descrito previamente. Además, no se sabía que estos cócteles estabilizarían los anticuerpos y permitirían la tinción rápida y eficaz con dos o más anticuerpos.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Por consiguiente, la presente invención proporciona reactivos que contienen anticuerpos primarios y un sistema de detección, que cumplen estos objetivos. Por lo tanto, la presente invención proporciona un medio para reducir notablemente la cantidad de etapas requeridas y proporciona la capacidad para llevar a cabo inmunoanálisis automáticos.

La presente invención se define en las siguientes reivindicaciones.

En un aspecto de la presente invención, se proporcionan composiciones que comprenden dos o más anticuerpos mezclados con diferentes reactivos.

En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan composiciones que comprenden reactivos adecuados para la detección del anticuerpo que contiene los reactivos.

En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan procedimientos para detectar dos o más antígenos en una sola muestra, usando composiciones de la invención. En una realización,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de detección de dos o más antígenos en una muestra, que comprende:

(i) poner en contacto simultáneamente una muestra, que previamente se ha puesto en contacto simultáneamente con un cóctel de anticuerpos primarios que comprende al menos un primer anticuerpo primario y al menos un segundo anticuerpo primario en una disolución acuosa tamponada para el cóctel de anticuerpos primarios, con una composición que comprende al menos un primer anticuerpo secundario y al menos un segundo anticuerpo secundario para formar al menos dos complejos de antígeno-anticuerpo en la 1 muestra, en el que el al menos un primer anticuerpo secundario se acopla con un resto de poli(fosfatasa alcalina) (poli-ALP) y el al menos un segundo anticuerpo secundario se acopla con un resto de poli(peroxidasa de rábano picante) (poli-HRP), y en el que la composición comprende un tampón para el primer y segundo anticuerpos secundarios; y

(ii) detectar los al menos dos complejos de antígeno-anticuerpo en la muestra.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que

el al menos un primer anticuerpo secundario es un anticuerpo de cabra dirigido contra Ig de ratón y el al 2 menos un segundo anticuerpo secundario es un anticuerpo de cabra dirigido contra Ig de conejo; o

el al menos un primer anticuerpo secundario es un anticuerpo de cabra dirigido contra Ig de conejo y el al menos un segundo anticuerpo secundario es un anticuerpo de cabra dirigido contra Ig de ratón.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la detección comprende aplicar DAB y Fast

Red a la muestra.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende detectar al menos 3 antígenos en una muestra, en el que el cóctel de anticuerpos primarios comprende además al menos un tercer anticuerpo

primario; y el procedimiento comprende además poner en contacto simultáneamente la muestra con al menos un tercer anticuerpo segundario para formar al menos un tercer complejo de antígeno-anticuerpo en la muestra y detectar el al menos un tercer complejo de anticuerpo-antígeno en la muestra.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra está contenida en un dispositivo 35 de tinción automático y en el que el contacto se produce en un dispositivo de tinción automático.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que al menos uno de los anticuerpos en el cóctel de anticuerpos primarios es un anticuerpo monoclonal de conejo.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la disolución acuosa tamponada para el

cóctel de anticuerpos primarios comprende 2-metil-4-isotiazolin-3-ona como conservante.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el al menos primer anticuerpo secundario es un anticuerpo conjugado con una pluralidad de restos de fosfatasa alcalina y el al menos segundo anticuerpo

secundario es un anticuerpo conjugado con una pluralidad de restos de peroxidasa de rábano picante.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende, después de (i) y antes de (ii),

aplicar al menos dos cromógenos diferentes que dan como resultado al menos dos colores diferentes.

1. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el primer anticuerpo primario es un anticuerpo

de ratón y el segundo anticuerpo primario es un anticuerpo de conejo, y en el que el primer anticuerpo secundario está acoplado a poli-ALP y el segundo anticuerpo secundario está acoplado a poli-HRP.

11. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que al menos uno de los anticuerpos primarios es

un anticuerpo de ratón y uno de los anticuerpos primarios es un anticuerpo de conejo, y en el que los anticuerpos secundarios que se unen a los anticuerpos primarios de ratón están acoplados a poli-ALP y el anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario de conejo está acoplado a poli-HRP, o los anticuerpos secundarios que se unen a los anticuerpos primarios de ratón están acoplados a poli-HRP y el anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario de conejo está acoplado a poli-ALP.