Procedimiento y disposición de circuito para el tratamiento de material biológico.

Procedimiento para el tratamiento de material biológico mediante como minimo un campo eléctrico generado por un primer impulso de tensión,

en donde el primer impulso de tensión se interrumpe cuando se sobrepasa por arriba o por abajo un valor límite predeterminado para un parámetro eléctrico, caracterizado por que después de la interrupción el primer impulso de tensión es seguido por como mínimo un otro impulso de tensión, en donde para el primer impulso de tensión se fija previamente una duración T1 determinada y la duración T2 del otro impulso de tensión es como mínimo igual a la duración T1 menos el intervalo de tiempo Tx existente entre el comienzo del primer impulso de tensión y la interrupción del mismo.

Procedimiento y disposición de circuito para el tratamiento de material biológico El invento se refiere a un procedimiento para el tratamiento de material biológico mediante como minimo un campo eléctrico generado mediante un primer impulso de tensión, en donde este primer impulso de tensión se interrumpe cuando se sobrepasa por arriba o por abajo un valor límite predeterminado para un parámetro eléctrico, así como a una disposición de circuito, especialmente para llevar a cabo el procedimiento, con como minimo un dispositivo acumulador para cantidades de carga eléctrica para la generación de como minimo un impulso de tensión mediante la descarga dirigida del dispositivo acumulador y como minimo un dispositivo de control para controlar la descarga, mediante el cual el impulso de tensión puede ser interrumpido al sobrepasarse por arriba o por debajo un valor límite predeterminado para un parámetro eléctrico. El invento se refiere entonces especialmente a los campos de electroporación, electrofusión y electrosimulación de células vivas, así como a todas las aplicaciones en las que el material biológico debe ser sometido a un campo eléctrico.

Fundamentos La introducción de moléculas biológicamente activas, como por ejemplo DNA, RNA o proteínas, en células vivas representa un importante instrumento para la investigación de funciones biológicas de estas moléculas. Un método preferido para la introducción de moléculas extrañas en las células es entonces la electroporación, la cual en oposición a los métodos químicos no está predispuesta para el transporte simultáneo de otras moléculas biológicamente activas. En la electroporación las moléculas extrañas son un introducidas en las células a partir de una solución de almacenamiento adaptada a las células o un medio de cultivo de células mediante una inyección de corta duración, con lo que mediante la acción del corto impulso eléctrico de tensión o del campo eléctrico producido por él la membrana de célula se hace permeable para las moléculas extrañas. La suspensión de células se encuentra entonces a menudo en una llamada cubeta, es decir, un recipiente pequeño abierto hacia arriba que en las proximidades de su fondo presenta dos electrodos paralelos opuestos en las paredes laterales, los cuales sirven para la aplicación de la tensión eléctrica. Mediante los "poros" que se producen durante corto tiempo en la membrana de célula las moléculas biológicamente activas alcanzan primeramente el citoplasma en el cual en su caso ya pueden desarrollar su función investigadora, y después de ello y bajo determinadas condiciones también en el núcleo de la célula.

Mediante la aplicación de corta duración de un fuerte campo eléctrico, es decir, de un corto impulso de tensión con alta densidad de corriente, también pueden fusionarse además células, derivados de células, partículas subcelulares y / o vesículas. En esta llamada electrofusión las células son puestas en estrecho contacto con membranas primeramente por ejemplo mediante un campo eléctrico alterno no homogéneo. Mediante la inmediata aplicación de un pulso de campo eléctrico se llega entonces a la interacción de partes de membrana que finalmente lleva a la fusión. Para la electrofusión se pueden utilizar entonces dispositivos operativos comparables, como para la electroporación. Y aún más las células vivas puede ser estimuladas mediante un campo eléctrico también de una manera que modifique sus propiedades.

Cuando se crea un campo eléctrico con una intensidad de campo de varios cientos de voltio por centímetro en una solución acuosa, la resistencia eléctrica se rompe en un período de tiempo muy corto, por ejemplo menor de 1 μs, y con ello la intensidad sube muy rápido y fuerte, pudiendo producirse entonces una llamada descarga de rayo. Cuando se produce una descarga de rayo y debido a la fuerte subida de potencia y calor en el corto periodo de tiempo se llega por un lado a apariciones físicas acompañantes como destellos, crepitaciones y salpicaduras de la solución y por otro lado a un daño irreversible o a la muerte de las células. Una descarga de rayo perjudica generalmente no sólo a la seguridad de las personas presentes y de los aparatos sino que lleva también a una pérdida del material biológico utilizado.

Estado de la técnica

Por el documento WO 02/086129 A1 se conoce una disposición de circuito para la introducción de moléculas biológicamente activas en el núcleo de célula de células eucariónticas mediante la corriente eléctrica, o para el tratamiento de células, derivados de células, partículas subcelulares y / o vesículas con corriente eléctrica, así como un procedimiento correspondiente. La disposición de circuito se compone de dos dispositivos de almacenamiento para cantidades de carga eléctrica, los cuales son alimentados cada uno de una parte de red de alta tensión. Los dispositivos de almacenamiento están unidos con un semiconductor de potencia para la transmisión de las cantidades de carga existentes en los dispositivos de almacenamiento a la suspensión de célula. Los semiconductores de potencia son controlados mediante un dispositivo de control o conectados. En esta disposición de circuito conocida está previsto además que como mínimo un primer impulso de tensión pueda ser transmitido sobre la suspensión de células con la tensión de condensador del dispositivo de almacenamiento por medio del control de un semiconductor de potencia durante un periodo de tiempo (T1) ajustado previamente. Para mayor seguridad del usuario y de las pruebas utilizadas está previsto que mediante una etapa de sobretensión esté

prevista una desconexión por sobreintensidad como mínimo durante el primer impulso de tensión, mediante la que se interrumpe el correspondiente impulso. La desconexión por sobreintensidad hace por ello posible la interrupción del impulso de tensión para el caso de que se sobrepasen los valores límite preajustados. También por ejemplo, cuando al construir un campo eléctrico la corriente sube muy rápidamente entonces se puede evitar una descarga de rayo y con ello un daño de las células mediante la interrupción del impulso de tensión. Pero esto tiene la desventaja de que dependiendo del momento de la interrupción el éxito del tratamiento no llega, así por ejemplo la eficiencia de la transacción es muy pequeña. Si se interrumpe el impulso de tensión en un momento muy temprano la correspondiente mezcla de reacción, a pesar de mantenerse la capacidad de vida de las células, debe ser desechada o en cualquier caso será utilizable en una cantidad muy pequeña.

El invento tiene por tanto la misión de crear un procedimiento y una disposición de circuito del tipo mencionado anteriormente que haga posible un tratamiento con éxito del material biológico incluso cuando el primer impulso de tensión ha sido interrumpido.

Descripción del invento De acuerdo con el invento, para la solución de la misión está previsto para el procedimiento que después de la interrupción el primer impulso de tensión sea seguido por como mínimo otro impulso de tensión. De manera sorprendente se ha mostrado que el éxito del tratamiento de las células puede quedar sin embargo asegurado si se continúa el impulso de tensión interrumpido. Mediante el otro impulso de tensión las células son sometidas a otro campo eléctrico el cual preferentemente corresponde al generado por el primer impulso de tensión de manera que el tratamiento interrumpido puede ser continuado y con ello puede llegar el éxito deseado. Así, mediante el procedimiento acorde con el invento, por ejemplo en una electroporación, se puede mejorar claramente la eficiencia de transfeccion en la transfección de células eucariónticas con ácidos nucleinicos mediante la continuación o repetición del impulso de tensión después de una descarga de rayo. La ventaja del procedimiento acorde con el invento consiste por tanto en que debido a la interrupción ocasional de un impulso de tensión se pueden evitar o disminuir resultados no previsibles o no reproducibles que pueden presentarse. Como parámetros eléctricos que pueden ocasionar la interrupción del impulso de tensión, son adecuados por ejemplo, una pendiente de un descenso de tensión (flanco) , una interrupción brusca de la resistencia, la intensidad de corriente o el aumento del gradiente de intensidad (flanco) . De acuerdo con el invento, la prosecución del impulso de tensión se produce por que para el primer impulso de tensión se prescribe una duración determinada T1 y la duración T2 del otro impulso de tensión es como minimo igual a la duración T1 menos el tiempo Tx existente entre el comienzo del primer impulso de tensión y la interrupción del mismo. De esta manera se... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para el tratamiento de material biológico mediante como minimo un campo eléctrico generado por un primer impulso de tensión, en donde el primer impulso de tensión se interrumpe cuando se sobrepasa por arriba o por abajo un valor límite predeterminado para un parámetro eléctrico, caracterizado por que después de la interrupción el primer impulso de tensión es seguido por como mínimo un otro impulso de tensión, en donde para el primer impulso de tensión se fija previamente una duración T1 determinada y la duración T2 del otro impulso de tensión es como mínimo igual a la duración T1 menos el intervalo de tiempo Tx existente entre el comienzo del primer impulso de tensión y la interrupción del mismo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que como T1 se elige una duración del intervalo desde 10 μs hasta 1 ms.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que como intensidad de campo del siguiente impulso de tensión se predetermina la misma intensidad de campo que para el primer impulso de tensión.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que se predetermina una intensidad de campo de 2 hasta 10 kV / cm.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que entre la interrupción del primer impulso de tensión y la generación del otro impulso de tensión hay prefijado un determinado tiempo de pausa.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado por que como tiempo de pausa se predetermina un intervalo de tiempo de como mínimo 40 μs, preferentemente 50 hasta 600 μs, especialmente 100 μs.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que en total se generan como mínimo 2, preferentemente 2 o 3 otros impulsos de tensión cuando los otros impulsos de tensión precedentes se han interrumpido

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que para el primer impulso de tensión se predetermina una duración T1 determinada y la duración total Ts del otro impulso de tensión es como mínimo igual a la duración T1 menos el intervalo de tiempo Tx existente entre el comienzo del primer impulso de tensión y la interrupción del mismo.

9. Disposición de circuito (1) especialmente para el tratamiento de material biológico mediante como minimo un campo eléctrico generado por un primer impulso de tensión, con como minimo un dispositivo acumulador (7) para cantidades de carga eléctrica para la generación de como minimo un impulso de tensión mediante la descarga controlada del dispositivo acumulador (7) y como mínimo un dispositivo de control (20) para controlar la descarga, mediante el cual el impulso de tensión puede ser interrumpido al sobrepasarse por arriba o por abajo un valor límite predeterminado para un parámetro eléctrico, caracterizada por que está previsto como mínimo un dispositivo de mando (4) para detectar el discurso en el tiempo del impulso de tensión, mediante el cual se puede controlar una continuación de la descarga después de la interrupción.

10. Disposición de circuito según la reivindicación 9, caracterizada por que el dispositivo de mando (4) es un componente analógico de procesamiento de señal, por ejemplo un condensador.

11. Disposición de circuito según la reivindicación 9, caracterizada por que el dispositivo de mando (4) es un componente digital de procesamiento de señal, por ejemplo un DSP.

12. Disposición de circuito según la reivindicación 9, 10 u 11, caracterizada por que el dispositivo de mando (4) y/ o el dispositivo de control (20) está / están unidos con un dispositivo de conexión (21) .

13. Disposición de circuito según la reivindicación 12, caracterizada por que el dispositivo de conexión (21) está unido con un interruptor de tensión (13) preferentemente a través de una etapa de separación de potencial (11) .

14. Disposición de circuito según una de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizada por que el dispositivo acumulador (7) está unido con un semiconductor de potencia (9) a través del que se realiza la descarga del dispositivo acumulador (7) .

15. Disposición de circuito según una de las reivindicaciones 13 o 14, caracterizada por que el interruptor de tensión (13) está unido con el semiconductor de potencia (9) .

16. Disposición de circuito según una de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizada por que el dispositivo de conexión (21) puede ser conectado mediante el dispositivo de control (20) .

17. Disposición de circuito según una de las reivindicaciones 9 a 16, caracterizada por que el dispositivo de control (20) contiene un dispositivo de desconexión el cual interrumpe la descarga si se ha sobrepasado por arriba o por abajo un valor límite predeterminado para un parámetro eléctrico.

18. Disposición de circuito según una de las reivindicaciones 12 a 17, caracterizada por que el dispositivo de conexión (21) puede ser conectado a través del dispositivo de mando (4) , preferentemente por el dispositivo de control (20) .