Plantas y células vegetales que se han modificado en multiplicación celular y desarrollo/diferenciación.

Una planta transgénica que comprende o alberga una célula vegetal transformada con un vector que comprende los siguientes (i) a (iii):

(i) un promotor transcribible en una célula vegetal,

(ii) un ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 53 unida a dicha secuencia promotora en una dirección con sentido, y

(iii) una señal para terminación de la transcripción y poliadenilación de una molécula de ARN,

en la que la cantidad de ADN expresado que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 53 aumenta y su crecimiento celular se suprime en comparación con la planta de tipo silvestre correspondiente que no comprende el vector.

Plantas y células vegetales que se han modificado en multiplicación celular y desarrollo/diferenciación Campo de la invención

La presente invención se refiere a plantas con un gen controlado genéticamente implicado en su crecimiento celular. Antecedentes de la invención

Las plantas tienen características embriológicas distintivas diferentes de las de otros eucariotas. Ya que las células vegetales no migran, se cree que la división celular, extensión y muerte celular programada determinan la morfogénesis. Las células proliferan en tejidos meristemáticos que existen en ambos polos de un extremo de brote y un extremo de raíz. Las células proliferadas se diferencian y se apilan para desarrollarse en una planta. El tamaño de una planta se determina por el número y tamaño de células constituyentes para formar la planta. Las plantas controlan el crecimiento celular (proliferación celular) regulando el ciclo celular de modo que los tamaños de las plantas se adaptan a condiciones ambientales cambiantes. La regulación del ciclo celular es importante para la diferenciación de plantas. Por ejemplo, las células peñcíclicas de las raíces permanecen en un periodo específico (fase G2) del ciclo celular, y la diferenciación de las raíces laterales se determina por si las células comienzan o no a dividirse. El número de las células del hipocotilo está regulado en plantas, pero el ciclo celular cambia en oscuridad y el tamaño de la célula cambia por endorreduplicación.

Se cree que un método para controlar la división celular de plantas, en particular un método para regular el ciclo celular es importante como un nuevo método para cultivo de plantas que trata de forma colectiva asuntos tales como el crecimiento, las formas y la respuesta a tensión.

Una célula se divide en dos células descendientes mediante una señe de procesos denominados ciclo celular que consiste en cuatro fases; es decir fase de intervalo 1 (fase G1), fase de síntesis de ADN (fase S), fase de intervalo 2 (fase G2) y fase de mitosis (fase M). Se han observado y estudiado mecanismos relacionados con la regulación de las fases S y M del ciclo celular. En las dos fases, la fase M, denominada fase de división mitótica, es una fase para distribuir igualmente los cromosomas duplicados en la fase S en células descendientes. Para la entrada en la fase M, las ciclinas (un representante es la Ciclina B) se unen con quinasa dependiente de ciclina (CDK) para formar un complejo activado para potenciar la agregación de cromosomas y rotura de las membranas nucleares. La fase B termina después de un proceso llamado citocinesis (división citoplasmática) para dividir el citoplasma después de la distribución de los cromosomas en dos. En células vegetales, el fragmoplasto que es una estructura específica de la planta se forma y progresa la división citoplasmática. La formación de fragmoplastos se regula por proteínas de tipo quinesina; es decir NACK1 y NACK2.

La ciclina B, NACK1 y NACK2 que tienen funciones importantes en el proceso de la entrada en la fase M hasta la terminación de la fase M en células vegetales muestran patrones de expresión génica específicos de fases G2/M. Se ha indicado que una secuencia de control específica denominada activador específico de M (MSA) que existe en una región promotora controla la expresión específica de fase de estos genes (Documento No de Patente 1). Además de una CDK específica de planta, CDKB, y genes que tienen altas similitudes con enzimas E2 específicas de ciclina entre las enzimas E2 relacionadas con la proteólisis, se ha indicado que diversos genes funcionalmente desconocidos tiene patrones de expresión específicos de fase M. Muchos de estos genes se analizan para incluir secuencias de MSA en regiones promotoras. Por lo tanto, se cree que los mecanismos para regular la expresión génica específica de fase G2/M por secuencias de MSA están universalmente conservados en plantas.

Se han identificado NtmybAI, NtmybA2 y NtmybB (denominados de forma colectiva en lo sucesivo en el presente documento Ntmyb) del tabaco como factores de unión a MSA. Las secuencias de aminoácidos de proteínas Ntmyb tienen característicamente altas similitudes con la región de unión a ADN de myb que tiene una secuencia compuesta de tres repeticiones imperfectas existentes en c-myb animal y otros (dichas proteínas que contienen esta región de unión a ADN se denominan en lo sucesivo en el presente documento 3Rmyb). Muchas plantas tiene genes que portan regiones de unión al ADN de tipo myb, pero la mayoría de ellas están constituidas por dos repeticiones de región myb o regiones myb de tipo no repetido. Por ejemplo, Arabidopsis thaliana la secuenciación de cuyo genoma se ha completado tiene más de cien genes que contienen región de unión a ADN de tipo myb, pero solamente cinco genes contienen la región de unión a ADN de tipo myb anteriormente mencionada compuesta de tres repeticiones de myb imperfectas (3Rmyb). Por lo tanto, dichos genes se conocen como miembros específicos entre superfamilias que constituyen el grupo de proteínas de tipo myb de plantas (Documento No de Patente 2). Se han realizado experimentos de control de la transcripción con genes indicadores para investigaciones sobre las funciones de Ntmyb usando sistemas de expresión transitoria en células vegetales. Se ha indicado que NtmybAI y NtmybA2 activaban la transcripción del promotor de ciclina B (CYM) y el promotor de NACK 1 de vinca pervinca (Catharanthus roseus), y viceversa NtmybB suprimía esta transcripción, lo que indica por lo tanto que Ntmyb eran capaces de unirse con MSA, y actuaban como factores de control de la transcripción para genes que mostraban expresión específica de fase G2/M (Documento No de Patente 3). Sin embargo, estos informes se basan únicamente en los resultados de transcripción de genes indicadores activada por Ntmyb expresados de forma

transitoria en un punto en el ciclo celular regulado por la expresión cíclica de numerosos genes. Por lo tanto, no ha habido ningún informe que desvele funciones de Ntmyb en el ciclo celular y la división celular aún.

Ha habido ejemplos de informes que desvelan que el crecimiento y desarrollo de plantas se modificó por la transformación con genes de expresión específica de fase G2/M. Por ejemplo, la elongación de las raíces se potenció en plantas transformadas que expresaban ciclina B de forma ectópica (Documento No de Patente 4); y la división citoplasmática fue incompleta para acortar la altura de la planta en plantas que tenían expresión suprimida de NACK1 esencial para la terminación de la fase M o en plantas transformadas que tenían construcciones de NACK1 negativas dominantes (Documento No de Patente 5). Sin embargo, estos ejemplos son los enfoques para el control de crecimiento celular utilizando genes individuales que se relacionan con el progreso de la fase M. Por lo tanto, no ha habido informes que desvelen plantas transformadas en las que se regule de forma colectiva la expresión de genes específicos de fase G2/M incluyendo genes desconocidos funcionalmente, regulados por secuencias MSA.

Ntmyb contiene una región de unión a ADN de myb que tiene alta homología con c-myb. Se cree que la función transcripcional de c-myb es inactiva cuando el motivo EVES existente en dicha proteína se une con el dominio de unión a ADN de myb, y se activa cuando la fosforilación del motivo EVES con una proteína quinasa conduce a un cambio en la conformación proteica, permitiendo de este modo la unión del coactivador P1 con la región de unión a ADN de myb (Documento No de Patente 6). Ya que se observa que las regiones distintas de las regiones de unión a ADN de myb no son similares entre Ntmyb y c-myb, y secuencias reguladoras tales como el motivo EVES no están conservadas, el mecanismo para controlar la capacidad de Ntmyb para activar la transcripción se cree que es diferente del de la proteína c-myb. No ha habido informes que desvelen la presencia de una región para controlar la capacidad activadora de la transcripción de Ntmyb. Se han indicado ADN que codifican 3Rmyb de longitud completa solamente en tabaco y Arabidopsis thaüana que son plantas dicotiledóneas, pero no ha habido informes sobre 3Rmyb de longitud completa de plantas monocotiledóneas. Esto significa que no hay informes que revelen si los mecanismos para regular la expresión génica específica de fase G2/M, mediada por secuencia de MSA y 3Rmyb, están conservados o no en plantas monocotiledóneas y plantas dicotiledóneas.

La mayoría de los animales son diploides, pero se conocen ampliamente diversos niveles de ploidía en plantas. Triticum es hexaploide, y Asterales es decaploide. Un gran número de estas plantas con poliploidía tienen en general caracteres y propiedades... [Seguir leyendo]

1. Una planta transgénica que comprende o alberga una célula vegetal transformada con un vector que comprende los siguientes (i) a (iii):

(i) un promotor transcribible en una célula vegetal,

(ii) un ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID N2: 53 unida a dicha secuencia promotora en una dirección con sentido, y

(iii) una señal para terminación de la transcripción y poliadenilación de una molécula de ARN,

en la que la cantidad de ADN expresado que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID N2: 53 aumenta y su crecimiento celular se suprime en comparación con la planta de tipo silvestre correspondiente que no comprende el vector.