Plantas transgénicas modificadas para el transporte de cadmio reducido, productos derivados y métodos relacionados.

Una construcción de ARNi de NtHMA capaz de inhibir la expresión de un ARN mensajero de NtHMA al que

correspondecomprendiendo o consistiendo la construcción en:

una primera secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con una parte de la SEQ ID NO: 3 o 47;

una segunda secuencia; y

una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, situada en la misma orientación que la primera secuencia,

en donde la segunda secuencia está situada entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia está operativamente unida a la primera secuencia y a la tercera secuencia.

Plantas transgénicas modificadas para el transporte de cadmio reducido, productos derivados y métodos relacionados.

CAMPO TÉCNICO

Composiciones, vectores de expresión, polinucleótidos, polipéptidos, plantas transgénicas, líneas celulares transgénicas y semillas transgénicas, y métodos para hacer y usar estas realizaciones para producir varias plantas que pueden reducir el transporte de metales pesados a partes aéreas.

ANTECEDENTES

Las plantas obtienen metales pesados esenciales, tales como Zn, Ni y Cu, absorbiendo sustratos de iones metálicos de su entorno por varios mecanismos de transporte mediados por los transportadores de transmembrana expresados en la superficie de las células de las raíces y otros tejidos vasculares. Los transportadores clasificados como ATPasas de tipo P, tales como las ATPasas de tipo P1B, son transportadores que translocan sustratos 15 positivamente cargados a través de las membranas plasmáticas usando energía liberada de reacciones de hidrólisis de ATP exergónicas. Las ATPasas de tipo P1B también se denominan ATPasas de metales pesados (“HMA”) o ATPasas de tipo CPx. Las HMA se han agrupado por especificidad de sustrato en dos clases, los grupos de Cu/Ag y Zn/Co/Cd/Pb. La primera ATPasa de tipo P1B en ser caracterizada en plantas es la AtHMA4, clonada de Arabidopsis. La selectividad de sustrato por las HMA no está estrictamente limitada al transporte de metales 20 esenciales en cuanto que pueden ser reconocidos varios metales no esenciales indiscriminadamente como sustratos, dando como resultado la acumulación de muchos metales no esenciales, tales como Cd, Ph As y Hg. Lugon-Moulin et al. (Advances in Agronomy 83:111-180, 2004) revisa procedimientos para reducir el contenido de cadmio de plantas del tabaco.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Varios aspectos de la invención se dirigen a composiciones y métodos para producir plantas transgénicas incluyendo plantas del tabaco transgénicas, genéticamente modificadas para impedir el transporte de cadmio (Cd) desde el sistema radicular a la lámina foliar, reduciendo los niveles de expresión de transportadores de la familia de HMA. Se ha identificado un homólogo de la HMA (“NtHMA”) en el tabaco, que se puede usar para construir varias 30 construcciones de ARNi, que codifican polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés, que pueden facilitar la degradación de transcritos de ARN de NtHMA endógenos. Las plantas transgénicas que pueden expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA según la invención, se pueden usar para reducir los niveles en estado de equilibrio de los transcritos de ARN de NtHMA, y por consiguiente, para reducir el número de transportadores de NtHMA funcionalmente activos disponibles para transportar metales a través de las membranas celulares. 35

Otros aspectos de la invención se dirigen a vectores de expresión recombinantes que comprenden varias construcciones de ARNi de NtHMA y productos consumibles que incorporan hojas derivadas de plantas transgénicas producidas según los métodos descritos.

Según la presente invención, se proporciona en un aspecto una construcción de ARNi de NtHMA capaz de inhibir la expresión de un ARN mensajero de NtHMA al que corresponde, comprendiendo o consistiendo la construcción en:

una primera secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con una parte de la SEQ ID NO: 3 o 47; 45

una segunda secuencia; y

una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, situada en la misma orientación que la primera secuencia,

en donde la segunda secuencia está situada entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia está operativamente unida a la primera secuencia y a la tercera secuencia. 50

En la construcción de ARNi de NtHMA:

(a) la primera secuencia puede tener una identidad de secuencia de al menos 95% con una secuencia seleccionada de uno o más del grupo que consiste en: exón 1 como se define en la SEQ ID NO: 5, un 55 fragmento del exón 1 como se define en la SEQ ID NO: 5, exón 2 como se define en la SEQ ID NO: 7, un fragmento del exón 2 como se define en la SEQ ID NO: 7, exón 3 como se define en la SEQ ID NO: 9, un fragmento del exón 3 como se define en la SEQ ID NO: 9, exón 4 como se define en la SEQ ID NO: 11, un fragmento del exón 4 como se define en la SEQ ID NO: 11, exón 5 como se define en la SEQ ID NO: 13, un fragmento del exón 5 como se define en la SEQ ID NO: 13, exón 6 como se define en la SEQ ID NO: 15, un 60 fragmento del exón 6 como se define en la SEQ ID NO: 15, exón 7 como se define en la SEQ ID NO: 17, un fragmento del exón 7 como se define en la SEQ ID NO: 17, exón 8 como se define en la SEQ ID NO: 19, un fragmento del exón 8 como se define en la SEQ ID NO: 19, exón 9 como se define en la SEQ ID NO: 21, un fragmento del exón 9 como se define en la SEQ ID NO: 21, exón 10 como se define en la SEQ ID NO: 23, un fragmento del exón 10 como se define en la SEQ ID NO: 23, exón 11 como se define en la SEQ ID NO: 25, y 65 un fragmento del exón 11 como se define en la SEQ ID NO: 25;

(b) la segunda secuencia puede tener una identidad de secuencia de al menos 95% con una secuencia seleccionada de uno o más del grupo que consiste en: intrón 1 como se define en la SEQ ID NO: 4, un fragmento del intrón 1 como se define en la SEQ ID NO: 4, intrón 2 como se define en la SEQ ID NO: 6, un fragmento del intrón 2 como se define en la SEQ ID NO: 6, intrón 3 como se define en la SEQ ID NO: 8, un fragmento del intrón 3 como se define en la SEQ ID NO: 8, intrón 4 como se define en la SEQ ID NO: 10, un 5 fragmento del intrón 4 como se define en la SEQ ID NO: 10, intrón 5 como se define en la SEQ ID NO: 12, un fragmento del intrón 5 como se define en la SEQ ID NO: 12, intrón 6 como se define en la SEQ ID NO: 14, un fragmento del intrón 6 como se define en la SEQ ID NO: 14, intrón 7 como se define en la SEQ ID NO: 16, un fragmento del intrón 7 como se define en la SEQ ID NO: 16, intrón 8 como se define en la SEQ ID NO: 18, un fragmento del intrón 8 como se define en la SEQ ID NO: 18, intrón 9 como se define en la SEQ ID NO: 20, un 10 fragmento del intrón 9 como se define en la SEQ ID NO: 20, intrón 10 como se define en la SEQ ID NO: 22, un fragmento del intrón 10 como se define en la SEQ ID NO: 22, intrón 11 como se define en la SEQ ID NO: 24, un fragmento del intrón 11 como se define en la SEQ ID NO: 24, intrón 12 como se define en la SEQ ID NO: 26, y un fragmento del intrón 12 como se define en la SEQ ID NO: 26;

(c) la tercera secuencia puede tener una identidad de secuencia de al menos 95% con una secuencia 15 seleccionada de uno o más del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 27, un fragmento de la SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, un fragmento de la SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, un fragmento de la SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, un fragmento de la SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, un fragmento de la SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, un fragmento de la SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33, un fragmento de la SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, un fragmento de la SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, un fragmento de la SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, 20 un fragmento de la SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, y un fragmento de la SEQ ID NO: 37;

(d) la primera secuencia puede comprender la SEQ ID NO: 38, la segunda secuencia puede comprender la SEQ ID NO: 39, y la tercera secuencia puede comprender la SEQ ID NO: 40;

(e) la primera secuencia puede comprender la SEQ ID NO: 42, la segunda secuencia puede comprender la SEQ ID NO: 43, y la tercera secuencia puede comprender la SEQ ID NO: 44; o 25

(f) uno o dos o tres de (a) , (b) , (c) , (d) y (e) .

Además, en la construcción de ARNi de NtHMA, la primera y la segunda secuencia puede tener cada una, una longitud seleccionada del grupo que consiste en 20-30 nucleótidos, 30-50 nucleótidos, 50-100 nucleótidos, 100-150 nucleótidos, 150-200 nucleótidos, 200-300 nucleótidos, 300-400 nucleótidos, 400-500 nucleótidos, 500-600 30 nucleótidos y 600-700 nucleótidos.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un vector de expresión que comprende un promotor situado en la dirección 5’ y operativamente unido a la construcción de ARNi de NtHMA de la invención.

En el vector de expresión, el promotor se puede seleccionar del grupo que consiste en: un promotor específico de tejido, un promotor inducible y un promotor constitutivo.

Además según la presente invención, se proporciona una planta transgénica que comprende el ARNi de la invención y que tiene niveles de Cd reducidos en al menos una parte de la planta comparado con la parte en un homólogo no 40 transgénico.

La planta transgénica puede ser... [Seguir leyendo]

1. Una construcción de ARNi de NtHMA capaz de inhibir la expresión de un ARN mensajero de NtHMA al que corresponde, comprendiendo o consistiendo la construcción en:

una primera secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con una parte de la SEQ ID 5 NO: 3 o 47;

una segunda secuencia; y

una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, situada en la misma orientación que la primera secuencia,

en donde la segunda secuencia está situada entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda 10 secuencia está operativamente unida a la primera secuencia y a la tercera secuencia.

2. La construcción de ARNi de NtHMA de la reivindicación 1, en donde:

(a) la primera secuencia tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con una secuencia seleccionada 15 de uno o más del grupo que consiste en: exón 1 como se define en la SEQ ID NO: 5, un fragmento del exón 1 como se define en la SEQ ID NO: 5, exón 2 como se define en la SEQ ID NO: 7, un fragmento del exón 2 como se define en la SEQ ID NO: 7, exón 3 como se define en la SEQ ID NO: 9, un fragmento del exón 3 como se define en la SEQ ID NO: 9, exón 4 como se define en la SEQ ID NO: 11, un fragmento del exón 4 como se define en la SEQ ID NO: 11, exón 5 como se define en la SEQ ID NO: 13, un fragmento del exón 5 20 como se define en la SEQ ID NO: 13, exón 6 como se define en la SEQ ID NO: 15, un fragmento del exón 6 como se define en la SEQ ID NO: 15, exón 7 como se define en la SEQ ID NO: 17, un fragmento del exón 7 como se define en la SEQ ID NO: 17, exón 8 como se define en la SEQ ID NO: 19, un fragmento del exón 8 como se define en la SEQ ID NO: 19, exón 9 como se define en la SEQ ID NO: 21, un fragmento del exón 9 como se define en la SEQ ID NO: 21, exón 10 como se define en la SEQ ID NO: 23, un fragmento del exón 25 10 como se define en la SEQ ID NO: 23, exón 11 como se define en la SEQ ID NO: 25, y un fragmento del exón 11 como se define en la SEQ ID NO: 25;

(b) la segunda secuencia tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con una secuencia seleccionada de uno o más del grupo que consiste en: intrón 1 como se define en la SEQ ID NO: 4, un fragmento del intrón 1 como se define en la SEQ ID NO: 4, intrón 2 como se define en la SEQ ID NO: 6, un fragmento del intrón 2 30 como se define en la SEQ ID NO: 6, intrón 3 como se define en la SEQ ID NO: 8, un fragmento del intrón 3 como se define en la SEQ ID NO: 8, intrón 4 como se define en la SEQ ID NO: 10, un fragmento del intrón 4 como se define en la SEQ ID NO: 10, intrón 5 como se define en la SEQ ID NO: 12, un fragmento del intrón 5 como se define en la SEQ ID NO: 12, intrón 6 como se define en la SEQ ID NO: 14, un fragmento del intrón 6 como se define en la SEQ ID NO: 14, intrón 7 como se define en la SEQ ID NO: 16, un fragmento del intrón 7 35 como se define en la SEQ ID NO: 16, intrón 8 como se define en la SEQ ID NO: 18, un fragmento del intrón 8 como se define en la SEQ ID NO: 18, intrón 9 como se define en la SEQ ID NO: 20, un fragmento del intrón 9 como se define en la SEQ ID NO: 20, intrón 10 como se define en la SEQ ID NO: 22, un fragmento del intrón 10 como se define en la SEQ ID NO: 22, intrón 11 como se define en la SEQ ID NO: 24, un fragmento del intrón 11 como se define en la SEQ ID NO: 24, intrón 12 como se define en la SEQ ID NO: 26, y un fragmento 40 del intrón 12 como se define en la SEQ ID NO: 26;

(c) la tercera secuencia tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con una secuencia seleccionada de uno o más del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 27, un fragmento de la SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, un fragmento de la SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, un fragmento de la SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, un fragmento de la SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, un fragmento de la SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, un 45 fragmento de la SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33, un fragmento de la SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, un fragmento de la SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, un fragmento de la SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, un fragmento de la SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, y un fragmento de la SEQ ID NO: 37;

(d) la primera secuencia comprende la SEQ ID NO: 38, la segunda secuencia comprende la SEQ ID NO: 39, y la tercera secuencia comprende la SEQ ID NO: 40; 50

(e) la primera secuencia comprende la SEQ ID NO: 42, la segunda secuencia comprende la SEQ ID NO: 43, y la tercera secuencia comprende la SEQ ID NO: 44; o (f) uno o dos o tres de (a) , (b) , (c) , (d) y (e) .

3. La construcción de ARNi de NtHMA de la reivindicación 1, en donde la primera y la segunda secuencia tienen 55 cada una, una longitud seleccionada del grupo que consiste e.

2. 30 nucleótidos.

3. 50 nucleótidos.

5. 100 nucleótidos.

10. 150 nucleótidos.

15. 200 nucleótidos.

20. 300 nucleótidos.

30. 400 nucleótidos.

40. 500 nucleótidos.

50. 600 nucleótidos, .

60. 700 nucleótidos.

4. Un vector de expresión que comprende un promotor situado en la dirección 5’ y operativamente unido a la 60 construcción de ARNi de NtHMA como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. El vector de expresión de la reivindicación 4, en donde el promotor se selecciona del grupo que consiste en: un promotor específico de tejido, un promotor inducible y un promotor constitutivo.

6. Una planta transgénica que comprende el ARNi de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que tiene niveles de Cd reducidos en al menos una parte de la planta comparado con la parte en un homólogo no transgénico.

7. La planta transgénica según la reivindicación 6, en donde la planta transgénica es una planta de tabaco.

8. Un producto de tabaco consumible que incorpora hojas que comprenden el ARNi de cualquiera de las 5 reivindicaciones 1-3 y recogidas de la planta transgénica de la reivindicación 6, de modo que las hojas tienen niveles reducidos de Cd comparado con hojas recogidas de un homólogo no transgénico cultivado en condiciones idénticas, en donde el producto tiene niveles reducidos de Cd comparado con un producto que incorpora hojas recogidas del homólogo no transgénico, y en donde el producto es un cigarro, un cigarrillo o un producto de tabaco sin humo.

9. El producto de la reivindicación 8, en donde el % de reducción de Cd puede ser un valor de al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%.

10. El producto de la reivindicación 8 o reivindicación 9, en donde el contenido de Cd es un valor en el intervalo de 15 aproximadamente 0, 01 a aproximadamente 0, 05 ppm, de aproximadamente 0, 01 a aproximadamente 0, 1 ppm, de aproximadamente 0, 01 a aproximadamente 0, 5 ppm, de aproximadamente 0, 01 a aproximadamente 1, 0 ppm, o de aproximadamente 0, 01 a aproximadamente 5 ppm.

11. Un método para reducir los niveles de Cd en al menos una parte de la planta, que comprende: 20

reducir niveles de un ARNm de NtHMA en la planta produciendo la expresión de una construcción de ARNi, en donde la NtHMA se selecciona del grupo que consiste en:

un polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia que tiene una identidad de secuencia de 25 al menos 70% con la SEQ ID NO: 1, y que codifica un transportador de NtHMA que tiene actividad de ATPasa de tipo P1B;

un polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 50% con la SEQ ID NO: 3;

un polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia que tiene una identidad de secuencia de 30 al menos 50% con la SEQ ID NO: 47;

un polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con la SEQ ID NO: 2, en donde el polipéptido es un transportador de NtHMA que tiene actividad de ATPasa de tipo P1B; y

un polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia que codifica un polipéptido que tiene 35 una identidad de secuencia de al menos 70% con la SEQ ID NO: 49, en donde el polipéptido es un transportador de NtHMA que tiene actividad de ATPasa de tipo P1B.

12. El método de la reivindicación 11, en donde la construcción de ARNi comprende:

una primera secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con una parte de la SEQ ID NO: 3 o 47;

una segunda secuencia; y

una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, situada en la misma orientación que la primera secuencia, 45

en donde la segunda secuencia está situada entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia está operativamente unida a la primera secuencia y a la tercera secuencia.

13. El método de la reivindicación 11 o reivindicación 12, en donde después de la expresión de la construcción de ARNi, la parte de la planta tiene un contenido de Cd reducido en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 50 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde después de la expresión de la construcción de ARNi, la parte de la planta tiene un contenido de Cd en el intervalo de aproximadamente 0, 01 a aproximadamente 0, 05 ppm, de aproximadamente 0, 01 a aproximadamente 0, 1 ppm, de aproximadamente 0, 01 a 55 aproximadamente 0, 5 ppm, de aproximadamente 0, 01 a aproximadamente 1, 0 ppm, o de aproximadamente 0, 01 a aproximadamente 5 ppm.