Microorganismos fijadores de CO2 obtenidos por ingeniería genética que producen productos basados en carbono de interés.

Una célula hospedadora microbiana fotosintética modificada genéticamente que produce etanol,

donde la célulahospedadora está modificada genéticamente para comprender un ácido nucleico modificado por ingeniería genéticaexógeno que codifica una actividad alcohol deshidrogenasa dependiente de NADPH.

Microorganismos fijadores de CO2 obtenidos por ingeniería genética que producen productos basados en carbono de interés 5

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud provisional de Estados Unidos Nº 61/033.411 presentada el 3 de marzo 2008; la Solicitud provisional de Estados Unidos Nº 61/033.402, presentada el 3 de marzo 2008; la Solicitud provisional de Estados Unidos Nº 61/044.419 presentada el 11 de abril 2008; la Solicitud provisional de Estados Unidos Nº 61/106.543 presentada el 17 de octubre 2008; y la Solicitud provisional de Estados Unidos Nº 61/121.532 presentada el 10 de diciembre 2008.

Campo La presente divulgación se refiere a mecanismos para conferir producción de productos basados en carbono a un organismo fotoautotrófico de modo que convierta eficazmente dióxido de carbono y luz en diversos productos basados en carbono, y en particular al uso de dichos organismos para la producción comercial de diversos productos basados en carbono de interés.

Antecedentes La fotosíntesis es un procedimiento por el que entidades biológicas utilizan la luz del sol y CO2 para producir azúcares para energía. La fotosíntesis, como ha evolucionado de forma natural, es un sistema extremadamente complejo con numerosos y poco entendidos bucles de retroalimentación, mecanismos de control e ineficacias del proceso. Este complicado sistema presenta obstáculos probablemente insuperables para enfoques de optimización de un factor cada vez o globales [Nedbal et al., Photosynth Res., 93 (1-3) : 223-34 (2007) ; Salvucci et al., Physiol Plant. 120 (2) :179-186 (2004) ; Greene et al., Biochem J., 404 (3) :517-24 (2007) ].

Los organismos fotoautotróficos existentes (es decir, plantas, algas y bacterias fotosintéticas) son poco adecuados para el bioprocesamiento industrial y por lo tanto no han demostrado viabilidad comercial para este fin. Dichos organismos tienen tiempo de duplicación lento (3-72 horas) en comparación con organismos heterotróficos industrializados tales como Escherichia coli (20 minutos) , lo que refleja productividades totales bajas. Además, las técnicas para manipulación genética (anulación, sobre-expresión de transgenes mediante integración o propagación plasmídica episómica) son ineficaces, consumen tiempo, son trabajosas o no existen.

Sumario Se describen en el presente documento rutas y mecanismos para conferir capacidad de producción de productos basados en carbono directa a organismos fotoautotróficos. Los fotoautótrofos productores de productos basados en carbono modificados por ingeniería genética resultantes permiten excepcionalmente la producción eficaz de productos basados en carbono directamente a partir de dióxido de carbono y luz, eliminando las etapas de procesamiento largas y caras que se requieren actualmente para generar biocombustibles y productos bioquímicos a partir de fuentes de biomasa incluyendo maíz, caña de azúcar, miscanthus, celulosa y otros. La invención 45 proporciona una célula hospedadora microbiana fotosintética modificada genéticamente que produce etanol, donde la célula hospedadora está modificada genéticamente para comprender un ácido nucleico modificado por ingeniería genética exógeno que codifica una actividad alcohol deshidrogenasa dependiente de NADPH. La invención también proporciona uso de la célula de la invención para producir etanol y un método para producir etanol, que comprende cultivar la célula de la invención y después aislar el etanol de dicha célula o medio de cultivo.

En algunos aspectos, la producción de etanol se optimiza canalizando el carbono lejos del glucógeno y hacia piruvato, etc. durante su exposición a la luz. Normalmente se forma glucógeno a la luz y se consume para reducir la energía en la oscuridad. En una realización, se atenúan o anulan genes de síntesis de glucógeno y en otras realizaciones, los genes glucolíticos se hacen constitutivos. En otros aspectos, se eliminan ciertas rutas de 55 fermentación, tales como las que conducen a acetato, lactato, succinato, etc., si están presentes.

En otros aspectos más, si debe implementarse un ciclo de luz-oscuridad, la producción de glucógeno se optimiza durante la exposición a la luz (a diferencia de la biomasa, etc.) y se aumenta el % de peso de células secas que puede ser glucógeno (es decir, la célula se modifica por ingeniería genética para contrarrestar cualquier limitación que evite que las células se hinchen llenas de glucógeno) . Después, durante la oscuridad, se permite que se realice síntesis de etanol a partir de glucógeno acumulado, habiendo atenuado o anulado las otras rutas de fermentación. Además, se desvela usar un ciclo de luz-oscuridad que coincide con las tasas de síntesis/catabolismo de glucógeno de modo que se pierda el tiempo mínimo (el glucógeno no se agota y las células se mantienen de forma no productiva en oscuridad, o hay demasiado glucógeno para consumir completamente durante el periodo de 65 oscuridad) .

El ácido nucleico modificado por ingeniería genética comprendido por la célula de la invención codifica una actividad alcohol deshidrogenasa dependiente de NADPH. En una realización, la actividad alcohol deshidrogenasa dependiente de NADPH es adhA de Moorella sp. HUC22-1. La secuencia codificante de alcohol deshidrogenasa dependiente de NADPH puede ser al menos 77, 1 % idéntica a SEC ID Nº 1. La alcohol deshidrogenasa dependiente de NADPH puede ser al menos 72 % idéntica a SEC ID Nº 2.

En otra realización, la célula de la invención también codifica una actividad piruvato descarboxilasa. En una realización relacionada, la actividad piruvato descarboxilasa se selecciona de la actividad pdc de Z. palmae yZ. mobilis. La secuencia codificante de alcohol deshidrogenasa dependiente de NADPH y/o la secuencia codificante de piruvato descarboxileno pueden estar bajo el control de un promotor inducible.

En ciertas realizaciones, la célula de la invención, en cultivo, es capaz de producir etanol en un rendimiento de al menos aproximadamente 249 mg/l de medio de cultivo en 72 horas. En ciertas otras realizaciones, el rendimiento es de al menos aproximadamente 296 mg/l de etanol durante 72 horas. En otras realizaciones más, el rendimiento de etanol es de 2, 5 a 5 g/l de medio de cultivo por hora. En otras realizaciones, el nivel de acetaldehído en dicho cultivo después de 72 horas es menor de aproximadamente 14 mg/l. En otras realizaciones, la célula en cultivo produce al menos aproximadamente 36 mg/l de etanol por DO, o al menos aproximadamente 47 mg/l de etanol por DO.

En realizaciones adicionales, la célula modificada genéticamente proporcionada por la invención comprende una célula selecciona de algas, cianobacterias, bacterias verdes del azufre, bacterias verdes no del azufre, bacterias púrpuras del azufre, bacterias púrpuras no del azufre, extremófilos, levaduras, hongos, organismos modificados por ingeniería genética de los mismos y organismos sintéticos. La célula es fotosintética. La célula de la invención puede ser un organismo de alga y/o cianobacteria seleccionado del grupo que consiste en Acanthoceras, Acanthococcus, Acar y ochloris, Achnanthes, Achnanthidium, Actinastrum, Actinochloris, Actinocyclus, Actinotaenium, Amphichr y sis, 25 Amphidinium, Amphikrikos, Amphipleura, Amphiprora, Amphithrix, Amphora, Anabaena, Anabaenopsis, Aneumastus, Ankistrodesmus, Ankyra, Anomoeoneis, Apatococcus, Aphanizomenon, Aphanocapsa, Aphanochaete, Aphanothece, Apiocystis, Apistonema, Arthrodesmus, Artherospira, Ascochloris, Asterionella, Asterococcus, Audouinella, Aulacoseira, Bacillaria, Balbiania, Bambusina, Bangia, Basichlamys, Batrachospermum, Binuclearia, Bitrichia, Blidingia, Botrdiopsis, Botr y dium, Botr y ococcus, Botr y osphaerella, Brachiomonas, Brachysira, Brachytrichia, Brebissonia, Bulbochaete, Bumilleria, Bumilleriopsis, Caloneis, Calothrix, Campylodiscus, Capsosiphon, Carteria, Catena, Cavinula, Centritractus, Centronella, Ceratium, Chaetoceros, Chaetochloris, Chaetomorpha, Chaetonella, Chaetonema, Chaetopeltis, Chaetophora, Chaetosphaeridium, Chamaesiphon, Chara, Characiochloris, Characiopsis, Characium, Charales, Chilomonas, Chlainomonas, Chlamydoblepharis, Chlamydocapsa, Chlamydomonas, Chlamydomonopsis, Chlamydomyxa, Chlamydonephris, Chlorangiella, Chlorangiopsis, Chlorella, 35 Chlorobotr y s, Chlorobrachis, Chlorochytrium, Chlorococcum, Chlorogloea, Chlorogloeopsis, Chlorogonium, Chlorolobion, Chloromonas, Chlorophysema, Chlorophyta, Chlorosaccus, Chlorosarcina, Choricystis, Chromophyton, Chromulina, Chroococcidiopsis, Chroococcus, Chroodactylon, Chroomonas, Chroothece, Chr y samoeba, Chr y sapsis, Chr y sidiastrum, Chr y socapsa, Chr y socapsella, Chr y sochaete, Chr y sochromulina,... [Seguir leyendo]

1. Una célula hospedadora microbiana fotosintética modificada genéticamente que produce etanol, donde la célula hospedadora está modificada genéticamente para comprender un ácido nucleico modificado por ingeniería genética 5 exógeno que codifica una actividad alcohol deshidrogenasa dependiente de NADPH.

2. La célula de la reivindicación 1, donde la actividad alcohol deshidrogenasa dependiente de NADPH es adhA de Moorella sp. HUC22-1.

3. La célula de la reivindicación 1 o 2, que también codifica una actividad piruvato descarboxilasa.

4. La célula de la reivindicación 3, donde la actividad piruvato descarboxilasa se selecciona de actividad pdc de Z. palmae yZ. Mobilis.

5. La célula de la reivindicación 1, donde la secuencia codificante de alcohol deshidrogenasa dependiente de NADPH es al menos 77, 1 % idéntica a SEC ID Nº 1.

6. La célula de la reivindicación 1, donde la alcohol deshidrogenasa dependiente de NADPH es al menos 72 %

idéntica a SEC ID Nº 2. 20

7. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la secuencia codificante de alcohol deshidrogenasa dependiente de NADPH y/o la secuencia codificante de piruvato descarboxilasa está bajo el control de un promotor inducible.

8. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la célula en cultivo es capaz de producir etanol en un rendimiento de al menos aproximadamente 249 mg/l de medio de cultivo en 72 horas, preferentemente donde

(i) el rendimiento es de al menos aproximadamente 296 mg/l de etanol durante 72 horas; 30 (ii) el rendimiento es de 2, 5 a 5 g/l de medio de cultivo por hora;

(iii) el nivel de acetaldehído en dicho cultivo después de 72 horas es de menos de aproximadamente 14 mg/l;

(iv) la célula en el cultivo produce al menos aproximadamente 36 mg/l de etanol por DO; o

(v) la célula en cultivo produce al menos aproximadamente 47 mg/l de etanol por DO.

9. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es una cianobacteria.

10. La célula de la reivindicación 9, que es Synechococcus sp. PCC 7002, Synechococcus sp. PCC 7942, Synechocystis sp. PCC 6803 o Thermosynechococcus elongatus BP-1.

11. Uso de la célula de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para producir etanol.

12. Un método para producir etanol, que comprende cultivar la célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y después aislar el etanol de dicha célula o medio de cultivo.

13. El método de la reivindicación 12, donde la célula se cultiva en un fotobiorreactor.