Método para la estandarización de resultados de medición en un sistema para la medición de la función de los trombocitos.

Método para la determinación de la función de los trombocitos en una muestra,

en donde el método comprende las siguientes etapas:

a) Utilización de una célula de medida, en donde la célula de medida presenta los siguientes elementos:

i) una cámara de retención para retener la muestra,

ii) un tubo capilar, a través del cual se conduce la muestra desde la cámara de retención hacia una cámara de medición,

iii) una cámara de medición que se divide en dos compartimentos mediante un elemento de separación, en donde el primer compartimento recibe la muestra que proviene del tubo capilar,

iv) un elemento de separación que divide la cámara de medición en dos compartimentos y que presenta un orificio, a través del cual la muestra puede fluir desde el primer compartimento hacia el segundo compartimento;

b) Llenado de la cámara de retención de la célula de medida con la muestra;

c) Posicionamiento de la célula de medida en un dispositivo para la determinación automática de la función de los trombocitos, en donde el dispositivo presenta los siguientes elementos:

i) Medios para la aplicación de una presión negativa en la cámara de medición de la célula de medida,

ii) Medios para la determinación del volumen completo, el cual se obtiene mediante la aplicación de una presión negativa desde la célula de medida, cuando en la cámara de medición de la célula de medida se aplica una presión negativa;

d) Aplicación de una presión negativa en la cámara de medición de la célula de medida, y conducción de la muestra a través del tubo capilar y a través del orificio del elemento de separación;

caracterizado porque el método comprende, además, las siguientes etapas:

e) Determinación del volumen de la muestra, el cual se presenta dentro de un intervalo de tiempo definido a través del orificio del elemento de separación, y

f) Comparación del volumen determinado de la muestra, con un valor de volumen de muestra de referencia para el funcionamiento normal de los trombocitos; o

g) Determinación del volumen de la muestra, el cual se presenta dentro de un intervalo de tiempo definido a través del orificio del elemento de separación, y

h) Determinación del caudal inicial, y

i) Establecimiento de la diferencia entre el quíntuplo del caudal inicial, y el volumen de la muestra, y comparación de la diferencia con un valor diferencial de referencia para la función normal de los trombocitos.

Método para la estandarización de resultados de medición en un sistema para la medición de la función de los trombocitos.

La presente invención se encuentra en el área del diagnóstico de la coagulación, y hace referencia a métodos in vitro para la determinación de la función de los trombocitos con la ayuda de células de medida. Los métodos permiten la obtención de resultados de medición que se pueden comparar entre sí, independientemente del tipo de célula de medida utilizado.

Los procesos fisiológicos que, por una parte, garantizan la fluidez de la sangre en el sistema vascular y, por otra parte, evitan pérdidas de sangre extravasculares mediante la formación de coágulos, se resumen bajo el término hemostasia. En la regulación de la hemostasia participan una pluralidad de factores proteicos, así como componentes celulares, como por ejemplo, los trombocitos (plaquetas sanguíneas) . En el caso de un daño vascular, en primer lugar se fijan trombocitos sobre el colágeno subendotelial. La adhesión mencionada se obtiene mediante proteínas adhesivas, como el factor de Willebrand (VWF) . Durante el proceso de adhesión se activan los trombocitos, y se liberan mediadores de sus gránulos, con lo cual se induce la agregación de trombocitos adicionales, así como un refuerzo de la activación. De esta manera, se realiza un cierre primario de las paredes vasculares (hemostasia primaria) , que se estabiliza mediante otras reacciones adicionales del sistema de coagulación plasmático (hemostasia secundaria) . Las regulaciones erróneas de los procesos mencionados, pueden conducir a una tendencia a la trombosis o a una tendencia a la hemorragia y, según la gravedad, puede presentar consecuencias que representan un peligro para la vida.

En el diagnóstico de la coagulación se conocen diferentes métodos y sistemas, con la ayuda de los cuales se puede determinar si la sangre de un paciente puede coagular perfectamente, o si existe una coagulación deficiente. En el caso de una coagulación deficiente, resulta necesario generalmente conocer con precisión la causa de la deficiencia existente, para poder seleccionar las medidas terapéuticas óptimas. Una función parcial importante del sistema de coagulación, que se puede investigar puntualmente, es la hemostasia primaria que depende esencialmente de la capacidad funcional de los trombocitos.

Un método conocido para la investigación de la función de los trombocitos, es la determinación del tiempo de hemorragia. En este caso, se trata de una prueba global in vivo, que detecta la hemostasia primaria. El tiempo de hemorragia se determina en tanto que al paciente se le causa una pequeña herida de corte o pinchazo, y se mide el tiempo hasta la detención de la hemorragia. Se trata de una prueba que difícilmente se puede estandarizar y es informativa a grandes rasgos, que se utiliza principalmente en situaciones de emergencia para obtener un panorama general de la hemostasia primaria. La toma de inhibidores de la agregación de trombocitos, conduce a una prolongación del tiempo de hemorragia. En la determinación del tiempo de hemorragia, resulta una desventaja que durante un tiempo normal de hemorragia, no se pueda excluir una deficiencia en la función de los trombocitos.

Los métodos in vitro permiten una detección esencialmente más sensible de las deficiencias de la función de los trombocitos. En los métodos mencionados, en una muestra de sangre completa o en una muestra de plasma rico en plaquetas (PRP) , se induce convencionalmente la agregación de trombocitos mediante la adición de un agente activador, y se mide la reacción de la agregación. Los agentes activadores más utilizados, que se utilizan para la inducción de la agregación de trombocitos, son: ADP (adenosin-5â?-difosfato) , colágeno, epinefrina (adrenalina) , ristocetina y diferentes combinaciones de ellos, así como trombina, TRAP (proteína activadora del receptor de trombina) , U-46619, heparina (particularmente en el caso de trombocitopenia inducida por heparina) o serotonina.

Un sistema conocido para la determinación in vitro de la función de los trombocitos, es el denominado sistema analizador de la función plaquetaria, es decir, el sistema PFA (PFA-100®, PFA-200, Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Alemania) . Con la ayuda del sistema PFA, en las muestras de sangre completa se mide la hemostasia primaria bajo las condiciones del flujo y, de esta manera, en presencia de fuerzas de corte elevadas.

Para la simulación de las condiciones del flujo y de las fuerzas de corte, como se presentan en los vasos sanguíneos arteriales más pequeños, en una célula de medida PFA que se utiliza en la unidad de análisis de PFA, se genera una presión negativa de alrededor de -40 mbar, y la sangre completa tratada con citrato que se encuentra en un depósito de muestras, fluye a través del tubo capilar que presenta un diámetro de alrededor de 200 mm. Los tubos capilares desembocan en una cámara de medición que se encuentra cerrada con un elemento de separación, por ejemplo, una membrana, la cual presenta un orificio central capilar (abertura) , a través del cual pasa la sangre debido a la presión negativa. En la mayoría de los casos, en la membrana, al menos, en la zona alrededor de la abertura, se adiciona uno o una pluralidad de agentes activadores que inducen la agregación de los trombocitos, de manera que la sangre que fluye, entre en contacto con las sustancias que inducen la agregación, en la zona de la abertura. Debido a la adhesión y a la agregación inducida de los trombocitos, en la zona de la abertura se conforma un tapón de trombocitos (trombo) que cierra el orificio de la membrana y detiene el flujo sanguíneo. En el sistema mencionado, se mide el tiempo requerido hasta el cierre del orificio de la membrana. El tiempo de obturación mencionado presenta correlación con la capacidad funcional de los trombocitos. Una célula de medida para utilizar

en un método para la determinación de la función de los trombocitos mediante el tiempo de obturación, se describe, por ejemplo, en el documento de la patente WO 97/34698. Hasta el momento, en el método para la determinación del tiempo de obturación, se utilizan células de medida que se encuentran dotadas de una membrana que se encuentra recubierta con colágeno (Kol) y adicionalmente ya sea con ADP o con epinefrina (Epi) . Otras células de medida que resultan apropiadas particularmente para la determinación de antitrombóticos a partir del grupo de los antagonistas de P2Y (12) , como por ejemplo, de Clopidogrel, están provistas con una membrana que presenta ADP y prostaglandina E1 (INNOVANCE® PFA P2Y, EP-A1-1850134) .

Un método conocido para la determinación de la función de los trombocitos en una muestra, mediante un sistema PFA, comprende las siguientes etapas del método:

a) Utilización de una célula de medida, en donde la célula de medida presenta los siguientes elementos:

i) una cámara de retención para retener la muestra, ii) un tubo capilar, a través del cual la muestra se conduce desde la cámara de retención hacia una cámara de medición, iii) una cámara de medición que se divide en dos compartimentos mediante un elemento de separación, en donde el primer compartimento recibe la muestra que proviene del tubo capilar, iv) un elemento de separación que divide la cámara de medición en dos compartimentos y que presenta un orificio, a través del cual la muestra puede fluir desde el primer compartimento hacia el segundo compartimento;

b) Llenado de la cámara de retención de la célula de medida con la muestra;

c) Posicionamiento de la célula de medida en un dispositivo para la determinación automática de la función de los trombocitos, en donde el dispositivo presenta los siguientes elementos:

i) Medios para la aplicación de una presión negativa en la cámara de medición de la célula de medida, ii) Medios para la determinación del volumen completo, el cual se obtiene mediante la aplicación de una presión negativa desde la célula de medida, cuando en la cámara de medición de la célula de medida se aplica una presión negativa;

d) Aplicación de una presión negativa en la cámara de medición de la célula de medida, y conducción de la muestra a través del tubo capilar y a través del orificio del elemento de separación.

El volumen completo que se obtiene mediante la aplicación de una presión negativa desde la célula de medida, se determina de manera continua. A partir del volumen que se obtiene por unidad de tiempo desde la célula de medida, se determina el caudal (μL/min) .

El caudal decrece convencionalmente a lo largo del tiempo, dado que el tapón de trombocitos estrecha progresivamente... [Seguir leyendo]

1. Método para la determinación de la función de los trombocitos en una muestra, en donde el método comprende las siguientes etapas:

a) Utilización de una célula de medida, en donde la célula de medida presenta los siguientes elementos:

i) una cámara de retención para retener la muestra, ii) un tubo capilar, a través del cual se conduce la muestra desde la cámara de retención hacia una cámara de medición, iii) una cámara de medición que se divide en dos compartimentos mediante un elemento de separación, en donde el primer compartimento recibe la muestra que proviene del tubo capilar, iv) un elemento de separación que divide la cámara de medición en dos compartimentos y que presenta un orificio, a través del cual la muestra puede fluir desde el primer compartimento hacia el segundo compartimento;

b) Llenado de la cámara de retención de la célula de medida con la muestra;

c) Posicionamiento de la célula de medida en un dispositivo para la determinación automática de la función de los trombocitos, en donde el dispositivo presenta los siguientes elementos:

i) Medios para la aplicación de una presión negativa en la cámara de medición de la célula de medida, ii) Medios para la determinación del volumen completo, el cual se obtiene mediante la aplicación de una presión negativa desde la célula de medida, cuando en la cámara de medición de la célula de medida se aplica una presión negativa;

d) Aplicación de una presión negativa en la cámara de medición de la célula de medida, y conducción de la muestra a través del tubo capilar y a través del orificio del elemento de separación;

caracterizado porque el método comprende, además, las siguientes etapas:

e) Determinación del volumen de la muestra, el cual se presenta dentro de un intervalo de tiempo definido a través del orificio del elemento de separación, y f) Comparación del volumen determinado de la muestra, con un valor de volumen de muestra de referencia para el funcionamiento normal de los trombocitos; o g) Determinación del volumen de la muestra, el cual se presenta dentro de un intervalo de tiempo definido a través del orificio del elemento de separación, y h) Determinación del caudal inicial, y i) Establecimiento de la diferencia entre el quíntuplo del caudal inicial, y el volumen de la muestra, y comparación de la diferencia con un valor diferencial de referencia para la función normal de los trombocitos.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en la etapa e) o en la etapa g) , la determinación del volumen de la muestra, el cual se presenta dentro de un intervalo de tiempo definido a través del orificio del elemento de separación, se realiza mediante la medición del volumen completo, el cual se obtiene mediante la aplicación de una presión negativa desde la célula de medida, y la determinación de la diferencia entre el volumen completo medido, y el volumen muerto de la célula de medida utilizada.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en la etapa f) el volumen determinado de la muestra se expresa en relación con un valor de referencia para el volumen de la muestra, para la función normal de los trombocitos.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el valor de referencia para el volumen de la muestra, para la función normal de los trombocitos, asciende al 100 %.

5. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en la etapa i) la diferencia obtenida se expresa en relación con un valor diferencial de referencia para la función normal de los trombocitos. 6. Método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el valor diferencial de referencia para la función normal de los trombocitos, asciende al 100 %.