Método para determinar el factor XIII con la ayuda de material de referencia a base de plasma.

Método para la determinación cuantitativa del factor XIII en una muestra de plasma,

donde la actividad de la transglutaminasa del factor XIIIa activado se mide mediante el consumo oxidativo de NAD(P)H o de un análogo de NAD(P)H en la mezcla de prueba, y el valor de medición determinado se compara con valores de referencia que son determinados con la ayuda de materiales de referencia, caracterizado porque al menos los materiales de referencia que presentan una actividad reducida del factor XIII, en comparación con el valor estándar, consisten en plasma.

Método para determinar el factor XIII con la ayuda de material de referencia a base de plasma La presenta invención se encuentra dentro del campo del diagnóstico in vitro, y hace referencia a un método para determinar el factor XIII de coagulación de la sangre (factor XIII, F XIII) con la ayuda de material de referencia a base de plasma.

El factor XIII es un factor de coagulación de la sangre que actúa al final de la cascada de coagulación, y que desempeña un papel importante para el cierre permanente de las heridas. En la última fase de la coagulación de la sangre, la de la formación de fibrina, la trombina disocia fibrinógenos. Los monómeros de fibrina así originados se agregan de forma espontánea formando fibras largas, conformando finalmente una red densa y ramificada de polímeros solubles de fibrina. El factor XIII también es activado por la trombina, originándose con ello el factor XIIIa. El factor XIIIa provoca un entrecruzamiento de los polímeros de fibrina, debido a lo cual el coágulo de fibrina se vuelve mecánicamente más estable, menos deformable y más resistente a la disolución mediante la plasmina. Una deficiencia congénita o adquirida de factor XIII puede producir una propensión a hemorragias, trastornos en la curación de heridas, así como puede conducir a que se produzcan abortos. Debido a la relevancia clínica que posee, la determinación de factor XIII para excluir o determinar una deficiencia de factor XIII es una parte fundamental del diagnóstico de coagulación.

El factor XIIIa, la forma activada de la proenzima catalíticamente inactiva del factor XIII, es una transglutaminasa que cataliza el entrecruzamiento tridimensional de los polímeros de fibrina, mediante la conformación de enlaces intermoleculares de amidas entre cadenas laterales de aminoácidos de lisilo y glutaminilo de las moléculas de fibrina. En esta reacción se produce amoniaco (NH3) , además de liberarse iones de amonio (NH4+) . En adelante, con el objetivo de simplificar, el término amoniaco se utilizará tanto para denominar el amoniaco, así como también para denominar a los iones de amonio. El fenómeno de la producción de amoniaco es utilizado en diferentes métodos de prueba para la determinación del factor XIII: Muszbek, L. y otros [Clin. Chem. (1985) 31 (1) , 35-40] describen un método para determinar el factor XIII en muestras de plasma desfibrinadas, donde el factor XIII de la muestra es activado con trombina produciendo factor XIIIa. La muestra se mezcla, además, con β-caseína y etilamina, las cuales sirven como sustratos para la formación de enlaces intermoleculares de amida a través del factor Xllla. Para comprobar cuantitativamente el amoniaco liberado en esta reacción, la muestra se mezcla de forma adicional con NADPH (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato hidruro) y con componentes de una reacción con indicador dependiente de NADPH, a saber, con glutamato deshidrogenasa (GLDH) y α-quetoglutarato. En presencia de amoniaco la GLDH transforma el α-quetoglutarato en glutamato. Esta reacción consume además NADPH, y se produce NADP+ (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato) , la forma oxidada de NADPH. La NADP+ posee un espectro de absorción distinto del de la NADPH, de manera que la absorción (absorbancia o densidad óptica) de la mezcla de prueba se modifica proporcionalmente con respecto al consumo de NADPH y, con ello, proporcionalmente con respecto a la cantidad de amoniaco, y a la cantidad, así como a la actividad, del factor XIII. De manera alternativa, en esta mezcla de prueba puede utilizarse NADH en lugar de NADPH. A diferencia de la NADP+, junto con un máximo de absorción de aproximadamente 260 nm, la NADPH posee un máximo de absorción de aproximadamente 340 nm. La posición exacta de los picos máximos de absorción por lo general depende de diferentes parámetros, en particular de las constantes de dielectricidad y del valor del pH de la solución. Por lo general, el pico máximo de absorción de la NADPH se sitúa dentro del rango de 335 bis 345 nm. Por lo tanto, la medición del cambio en la absorción de la mezcla de prueba, por lo general, en el caso de una longitud de onda de aproximadamente340 ± 5 nm, posibilita la determinación cuantitativa del factor XIII en una muestra.

En la solicitud EP 336 353 A2, así en como Fickenscher y otros (Thromb Haemost. 1991, 65 (5) : 535-40) , se describe un método similar con el cual se determina la cantidad de factor XIII mediante el amoniaco liberado. En la solicitud EP 336 353 A2 se describe un método para determinar el factor XIII en muestras de plasma no tratadas previamente, las cuales contienen fibrina. Para impedir que se originen coágulos de fibrina que puedan generar alguna alteración en la mezcla de reacción, la muestra se mezcla de forma adicional con un inhibidor de agregación de fibrina. El factor XIII de la muestra es activado con trombina en presencia de iones de Ca2+, produciendo factor XIIIa. La muestra se mezcla, además, con un péptido sintético que contiene glutamina y con etil éster de glicina, los cuales sirven como sustrato para la formación de enlaces intermoleculares de amida mediante el factor XIIIa. Para comprobar cuantitativamente el amoniaco liberado en esta reacción, la muestra se mezcla de forma adicional con NADH (nicotinamida adenina dinucleótido hidruro) , y con componentes de una reacción con indicador dependiente de NADH, a saber, con glutamato deshidrogenasa (GLDH) y α-quetoglutarato. En presencia de amoniaco la GLDH transforma el α-quetoglutarato en glutamato. Esta reacción consume adicionalmente NADH y se produce NAD+, la forma oxidada de NADH. La NAD+ posee otro espectro de absorción distinto al de la NADH, de manera que la absorción de la mezcla de prueba se modifica proporcionalmente con respecto al consumo de NADH y, con ello, proporcionalmente con respecto a la cantidad de amoniaco, y de forma proporcional con respecto a la actividad enzimática del factor XIII y a la cantidad de factor XIII. De manera alternativa, en esta mezcla de prueba puede utilizarse NADPH en lugar de NADH. La medición del cambio en la absorción de la mezcla de prueba, en el caso de una longitud de onda de 340 nm, posibilita la determinación cuantitativa del factor XIII en una muestra. Una prueba

comercial, basada en el principio de prueba descrito en la solicitud EP 336 353 A2, es la prueba Berichrom ® F XIII Test de la empresa Siemens Healthcare Diagnostics.

En Karpati y otros, 2000, se revela un método para determinar cuantitativamente el factor XIII en una muestra de plasma, donde la actividad de transglutaminasa del factor XIIIa se mide mediante el consumo oxidativo de NADPH en la mezcla de prueba. Karpati y otros no indican que se utilice NADH o un análogo de NAD (P) H.

Con el fin de simplificar, el término NAD (P) H se utilizará cuando las ejecuciones hagan referencia tanto a la forma fosforilada como también a la forma no fosforilada de la NADH, es decir cuando se refiera tanto a la NADH como a la NADPH. Con el fin de simplificar, el término NAD (P) + se utilizará cuando las ejecuciones hagan referencia tanto a la forma fosforilada como también a la forma no fosforilada de la NADH+ en el estado oxidativo, es decir cuando se refiera tanto a la NAD+ como a la NADP+.

En los métodos de prueba descritos, en lugar de NADH o NADPH pueden emplearse también análogos de NADH o de NADPH, los así llamados análogos NAD (P) H. Se consideran preferentes aquellos análogos que presentan un máximo de absorción que se sitúa por encima de 350 nm. Un análogo es una sustancia que imita el efecto biológico de la fisiología deseada, es decir, en este caso por ejemplo una sustancia que puede actuar como la NAD (P) + o la NAD (P) H como cosustrato. Dicho análogo debe tratarse de un análogo en el cual la forma oxidativa y reducida posea máximos de absorción diferentes, donde el máximo de absorción del análogo de la NAD (P) H se sitúe por encima de 350 nm. Preferentemente, deben emplearse análogos de estructura en los cuales el grupo nicotinamida fue cambiado por otro grupo. Se consideran preferentes los compuestos cíclicos, en particular compuestos heterocíclicos, donde se consideran completamente preferentes los análogos de piridina, es decir por ejemplo, 3acetilpiridina, 3- (carb) -aldehído piridina, tionicotinamida, selenonicotinamida, etc.

Los métodos correspondientes al estado del arte, así como otros métodos para determinar la actividad del factor XIII, basados en la comprobación de la formación de amoniaco en la mezcla de prueba, presentan la desventaja de que en las muestras con bajas concentraciones de factor XIII se mide con frecuencia una actividad demasiado elevada del factor XIII. Incluso se ha observado que en muestras de plasma de pacientes con una... [Seguir leyendo]

1. Método para la determinación cuantitativa del factor XIII en una muestra de plasma, donde la actividad de la transglutaminasa del factor XIIIa activado se mide mediante el consumo oxidativo de NAD (P) H o de un análogo de NAD (P) H en la mezcla de prueba, y el valor de medición determinado se compara con valores de referencia que son determinados con la ayuda de materiales de referencia, caracterizado porque al menos los materiales de referencia que presentan una actividad reducida del factor XIII, en comparación con el valor estándar, consisten en plasma.

2. Método según la reivindicación 1, donde al menos un material de referencia que presenta una actividad reducida del factor XIII, en comparación con el valor estándar, consiste en una mezcla de plasma normal y de plasma con 10 deficiencia de factor XIII.

3. Método según una de las reivindicaciones precedentes, donde al menos un material de referencia que presenta una actividad reducida del factor XIII, en comparación con el valor estándar, consiste en plasma con deficiencia de factor XIII al que se agrega factor XIII aislado.

4. Método según una de las reivindicaciones precedentes, donde el material de referencia que no presenta actividad 15 del factor XIII consiste en plasma con deficiencia de factor XIII.

5. Método según una de las reivindicaciones precedentes, donde el material de referencia que presenta una actividad del factor XIII del 100 % consiste en plasma normal.

6. Método según una de las reivindicaciones precedentes, donde al menos un material de referencia que presenta

una actividad reducida del factor XIII, en comparación con el valor estándar, consiste en plasma normal al que se 20 agrega factor XIII aislado.

7. Método según una de las reivindicaciones precedentes, donde la actividad de la transglutaminasa del factor XIIIa activado se mide mediante el consumo oxidativo de un análogo de NAD (P) H en la mezcla de prueba, y donde el análogo de NAD (P) H es tio-NAD (P) H o seleno-NAD (P) H.