Método para aumentar el potencial implantatorio de embriones de mamíferos obtenidos por fecundación in vitro.

Método para aumentar el potencial implantatorio de embriones de mamíferos obtenidos por fecundación in vitro.

La presente invención contempla un método para aumentar el potencial implantatorio de embriones de mamíferos obtenidos por fecundación in vitro caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) desarrollo in vitro de los embriones obtenidos hasta cualquier fase del desarrollo pre-embrionario y b) cultivo de los embriones obtenidos en a) en un medio de cultivo enriquecido con metabolitos activos del estradiol.

Método para aumentar el potencial implantatorio de embriones de mamíferos obtenidos por Fecundación In Vitro.

Campo de la invención Esta invención pertenece, de forma general, al campo de la Reproducción Asistida en mamíferos, en concreto a las técnicas de Fecundación In Vitro y Transferencia Embrionaria (FIV-TE) . De forma particular, la presente invención se refiere a un nuevo método para la mejora de la implantación embrionaria de embriones obtenidos por Fecundación In Vitro, basado en la suplementación de los medios de cultivo empleados en este tipo de técnicas con metabolitos activos del estradiol.

Antecedentes de la invención Las necesidades metabólicas del embrión varían a medida que atraviesa las diferentes fases de desarrollo preimplantacional. Por esta razón, en embriones obtenidos por fecundación in vitro, la composición del medio de cultivo adquiere un papel protagonista.

Tradicionalmente, y con el objetivo de optimizar la composición del medio respecto a las necesidades puntuales del embrión en desarrollo, se han diseñado medios de cultivo secuenciales (Artini, P. G., Valentino, V., Cela, V., Cristello, F., Vite, A., Genazzani, A. R., 2004. A randomized control comparison study of culture media (HTF versus P1) for human in vitro fertilization. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 116, 196-200) , cuya composición varía en función al grado de desarrollo embrionario. Generalmente, el periodo que comprende desde la fecundación hasta el embrión de 4 a 8 células, requiere de un medio rico en lactatos y piruvatos (Biggers, J.D. (1987) . Pioneering mammalian embr y o culture. In The Mammalian Preimplantaion Embr y o (Ed. B.D.Bavister) , Plenum, New York. pp. 1-22.) , sin embargo, a partir de este momento, desde que se activa el genoma embrionario y hasta el final de desarrollo embrionario preimplantacional, el embrión aumenta sus necesidades de glucosa y disminuyen las de lactato y piruvato. Por otra parte, la optimización de los medios de cultivo pasa por la adición de aminoácidos esenciales y no esenciales que, junto a las vitaminas, adquieren una importancia especial tras la fase de compactación (Gardner DK, Lane M. Development of viable mammalian embr y os in vitro: evolution of sequential media. In: Cibelli JB, Lanza RP, Campbell KHS, West MD, eds. Principles of cloning. Amsterdam: Academic Press, 2002:187–213) . Otros componentes, añadidos al medio de cultivo como el EDTA o la Taurina protegen de la oxidación y ayudan a optimizar el desarrollo embrionario (De Silva, M., 1998. Culturing human embr y os with and without glucose. Fertil Steril. 69, 970-1) .

Existen algunos medios comerciales diseñados para incrementar las posibilidades de adhesión de los embriones transferidos. Éstos incluyen componentes como el hialuronato cuya función, al margen del potencial embrionario de implantación, facilitan el anclaje entre útero y embrión. En este sentido, la posibilidad de incrementar la capacidad propia del embrión para implantarse, supone un avance de ES 2 439 424 Al

enormes dimensiones en el ámbito de la reproducción asistida.

Las hormonas que participan en la preparación del útero para la implantación, en cuanto a la sincronización del útero receptivo y la adquisición de competencia por parte del embrión se refiere, son fundamentalmente la Progesterona (P4) (Franco, H. L., Jeong, J. W., Tsai, S. Y., Lydon, J. P., DeMayo, F. J., 2008. In vivo analysis of progesterone receptor action in the uterus during embr y o implantation. Semin Cell Dev Biol. 19, 178-86) y el Estradiol (E2) (Ma, W. G., Song, H., Das, S. K., Paria, B. C., Dey, S. K., 2003. Estrogen is a critical determinant that specifies the duration of the window of uterine receptivity for implantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2963-8) . Éstas disparan la denominada “ventana de implantación”, que se define como el periodo espacio-temporal sincronizado entre el útero y el embrión en el que se lleva a cabo la implantación.

El E2 actúa sobre sus receptores en el endometrio para inducir el estado receptivo y su metabolito el 4hidroxiestradiol (4OHE2) sería el encargado de mediar la activación del embrión mediante la sobreexpresión de los factores de crecimiento epidérmico EGF (Hamatani, T., Daikoku, T., Wang, H., Matsumoto, H., Carter, M. G., Ko, M. S., Dey, S. K. "Global gene expression analysis identifies molecular pathways distinguishing blastocyst dormancy and activation". Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 10326-31, 2004) y la activación de sus receptores (Paria, B.C., Elenius, K., Klagsbrun, M., Dey, S.K., 1999. Heparinbinding EGF-like growth factor interacts with mouse blastocysts independently of ErbB1: a possible role for heparan sulfate proteoglycans and ErbB4 in blastocyst implantation. Development 126, 1997-2005) . Se ha puesto de manifiesto recientemente que los factores de crecimiento epidérmico (EGF) son imprescindibles para que el embrión se implante correctamente (Lim, H. J., Dey, S. K., 2009. HB-EGF: a unique mediator of embr y o-uterine interactions during implantation. Exp Cell Res. 315, 619-26) .

Se ha comprobado que la respuesta del embrión con respecto a los EGF puede ser alterada administrando de manera exógena estrógenos o catecolestrogenos (Paria, B.C., Lim, H., Wang, X.N., Liehr, J., Das, S.K., Dey, S.K., 1998. Coordination of differential effects of primar y estrogen and catecholestrogen on two distinct targets mediates embr y o implantation in the mouse. Endocrinology 139, 5235-5246.) . En este artículo se utiliza 4OHE2 para tratar un modelo experimental de embriones de ratón sin capacidad de implantación (durmientes) obtenidos por ovarioectomia. El modelo se llevó a cabo exclusivamente en este tipo de embriones para comprobar que esta suplementación en el medio sustituye a la falta de este metabolito en las ratas ovarioectomizadas. Según estos experimentos el tratamiento de estos embriones con esta molécula consigue que estos embriones se implanten en ratonas subrogadas. El modelo descrito se lleva a cabo en día 4 (blastocisto) . Por lo tanto el ambiente endocrino del útero actúa sobre la síntesis de factores de crecimiento y el estado de afinidad de sus receptores señalando de esta forma el momento y lugar adecuados para la implantación.

Según los datos publicados en el último registro realizado por la Sociedad Española de Fertilidad (SEF) , las tasas reflejan un 22% de hijos nacidos por transferencia de embrión, cuando ésta se ha realizado a partir de ovocitos propios. Las causas por las cuales, el porcentaje de éxito tras una fecundación in vitro es tan reducido, pueden ser muchas. Con mucha frecuencia, los abortos se atribuyen a una reducida receptividad endometrial o a una mala calidad embrionaria. En este sentido cobran especial interés, las condiciones en las que se realiza el proceso de fecundación y desarrollo embrionario (Smith, G.D.,

ES 2 439 424 Al

Monteiro da Rocha, A., 2012. Advances in embr y o culture systems. Seminars in reproductive medicine 30, 214-221) .

Con el objetivo de mejorar las bajas tasas de éxito en los tratamiento de reproducción asistida, los autores de la presente invención, tras una importante labor de investigación, han demostrado por primera vez la utilidad del empleo de los metabolitos derivados del estradiol para la mejora de la tasa de implantación de los embriones obtenidos por fecundación in vitro, así como de su potencial para unir los factores de crecimiento que dirigen el proceso.

En base a esto, los autores de la presente invención, han desarrollado un método que permite aumentar, hasta en un 25%, el potencial implantatorio de los embriones obtenidos por Fecundación In Vitro. El método de la invención está basado en la suplementación del medio de cultivo, en el que permanecen los embriones antes de ser transferidos, con metabolitos activos derivados del estradiol, ajustando los valores de concentración y el momento de adición del metabolito al medio de cultivo para así optimizar las tasas de implantación en cada caso. Con este método se consigue reactivar la capacidad de implantación, originalmente afectada por el cultivo artificial, en los embriones obtenidos por fecundación in vitro.

El método de la invención permitiría así aumentar la tasa de implantación embrionaria en los ciclos de FIV-TE y de este modo contribuir a solucionar las bajas tasas de éxito que actualmente se producen en estos tratamientos. El empleo de este método en el mercado supondrá un aumento en el éxito de los tratamientos de reproducción asistida, tanto en clínicas de reproducción asistida humana como en veterinaria.

Descripción de los dibujos Figura 1. El gráfico representa las diferencias que se reflejan en el porcentaje de adhesión embrionaria...

1. Método para aumentar el potencial implantatorio de embriones de mamíferos obtenidos por fecundación in vitro caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) Desarrollo in vitro de los embriones obtenidos hasta cualquier fase del desarrollo preembrionario.

b) Cultivo de los embriones obtenidos en a) en un medio de cultivo enriquecido con metabolitos activos del estradiol.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el desarrollo de embriones en b) se lleva a cabo hasta la fase de mórula.

3. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque los metabolitos activos del estradiol se seleccionan de entre 4OHE2 y 2OHE2.

4. Método según la reivindicación 3, caracterizado porque el metabolito activo es 4OHE2.

5. Método, según la reivindicación 4, caracterizado porque la concentración de 4OHE2 en el medio de cultivo está comprendida entre 0, 01 y 1 μg/ml.

6. Método, según la reivindicación 5, caracterizado porque la concentración de 4OHE2 es de 1 μg/ml.

7. Método según la reivindicación 1, caracterizado por que el periodo de cultivo de los embriones en el paso b) se encuentre comprendido entre 2 y 24h previo a la transferencia.

8. Medio de cultivo que comprende metabolitos activos del estradiol para aumentar el potencial implantatorio de embriones de mamíferos obtenidos por fecundación in vitro.