Listeria obtenida por ingeniería genética y métodos de uso de la misma.

Un polinucleótido que comprende:

(a) un promotor; y

(b) un ácido nucleico unido operativamente al promotor,

en donde el ácido nucleico codifica una proteína de fusión que comprende:

(i) un ActA modificado que comprende al menos los primeros 59 residuos de aminoácido de SEQ ID NO:38 o SEQ ID NO:152, y menos de los primeros 380 aminoácidos de SEQ ID NO:38 o SEQ ID NO:152; y

(ii) un antígeno heterólogo.

Listeria obtenida por ingeniería genética y métodos de uso de la misma

DECLARACIÓN CON RESPECTO A LA INVESTIGACIÓN O DESARROLLO FEDERALMENTE PATROCINADOS

Esta invención se hizo, en parte, con apoyo del gobierno de los Estados Unidos bajo el Instituto Nacional de Cáncer NHI 1 K23CA 104160-01. El gobierno puede tener ciertos derechos sobre la invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona bacterias Listeria diseñadas, útiles para estimular el sistema inmune y tratar cánceres e infecciones. También se proporcionan polinucleótidos, socios de proteínas de fusión, y vectores deintegración útiles para modificar la Listeria y otras especies bacterianas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los cánceres y las infecciones pueden ser tratados al administrar reactivos que modulan el sistema inmune. Estos reactivos incluyen vacunas, citosinas, anticuerpos, y moléculas pequeñas, tales como oligodesoxinucleótidos CpG e imidazoquinolinas (véase, e.g., Becker (2005) Virus Genes 30:251-266; Schetter y Vollmer (2004) Curr. Opin:Drug Devel. 7:204-210; Majewski, et al. (2005) Int. J. Dermatol. 44:14-19) , Hofmann, et al. (2005) J. Clin. Virol. 32:8691; Huber, et al. (2005) Infection 33:25-29; Carter (2001) Nature Revs. Cancer 1:118-129; Dechant y Valaerius (2001) Crit. Revs. Oncol. 39:69-77; O'Connor, et al. (2004) Neurology 62:2038-2043) . Las vacunas, incluyendo las vacunas clásicas (organismos completos inactivados, extractos, o antígenos) , vacunas de célula dendrítica (DC) , y vacunas basadas en ácido nucleico, también son útiles para tratar los cánceres y las infecciones (véase, e.g., Robinson yAmara (2005) Nat. Med. Suppl. 11:S25-S32; Plotkin (2005) Nat. Med. Suppl. 11:S5-S11; Pashine, et al. (2005) Nat. Med. Suppl. 11:S63-S68; Larche y Wraith (2005) Nat. Med. Suppl. 11:S69-S76) . Otro reactivo útil para modular el sistema inmune es Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) , y este reactivo ha probado ser útil en el tratamiento de cánceres y tumores (véase, e.g., Brockstedt, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:13832-13837; Brockstedt, et al (2005) Nat. Med. 11:853-860) ; Starks, et al. (2004) J. Immunol. 173:420-427; Shen, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3987-3991) .

Las cepas Listeria recombinantes se han desarrollado como vacunas contra los virus y tumores (véase, e.g. Starks, et al. (2004) J. Immunol. 173:420-427; Gunn, et al. (2001) J. Immunol. 167:6471-6479; Ikonomidis, et al. (1994)

J. Exp. Med. 180:2209-2218; Mata, et al. (2001) Vaccine 19:1435-1445; Mata y Paterson (1999) J. Immunol. 163:14491456; Mata, et al. (1998) J. Immunol. 161:2985-2993; Friedman, et al. (2000) J. Virol. 74:9987-9993; Soussi, et al. (2002) Vaccine 20:2702-2712; Saklani-Jusforgues, et al. (2003) Infect. Immun. 71:1083-1090; Soussi, et al. (2000) Infect. Immunity 68:1498-1506; Tvinnereim, et al. (2002) Infect. Immunity 70:153-162; Rayevskaya, et al. (2002) J. Virol. 76:918-922; Frankel, et al. (l995) J. Immunol. 55:4775-4782; Jensen; et al. (1997) J. Virol. 71:8467-8474; Jensen, et al. (1997) Immunol. Rev. 158:147-157; Lin, et al. (2002) Int. J Cancer 102:629-637; Peters, et al. (2003) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 35:243-253; Peters, et al. (2003) J. Immunol. 170:5176-5187; Paterson (2003) Immunol. Res. 27:451-462; Paterson y Johnson (2004) Expert Rev. Vaccines 3:S119-S134; Ochsenbein, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9293-9298; Hess, et al. (2000) Adv. Immunol. 75:1-88) .

La L. monocytogenes tiene un tropismo natural para el hígado y bazo y, en cierto grado, otros tejidos tales como los intestinos delgados (véase, e.g., Dussurget, et al. (2004) Ann. Rev. Microbiol. 58:587-610; Gouin, et al. (2005) Curr. Opin. Microbiol. 8:35-45; Cossart (2002) Int. J. Med. Microbiol. 291:401-409; Vazquez-Boland, et al. (2001) Clin. Microbiol. Rev. 14:584-640; Schluter, et al. (1999) Immunobiol. 201:188-195) . Cuando la bacteria reside en los intestinos, el paso al flujo sanguíneo se media por las proteínas listeriales, tales como ActA e internalina A (véase, e.g., Manohar, et al. (2001) Infection Immunity 69:3542-3549; Lecuit, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6152-6157; Lecuit y Cossart (2002) Trends Mol. Med. 8:537-542) . Una vez que la bacteria entra a una célula huésped, el ciclo de vida de L. monocytogenes incluye el escape desde el fagolisosoma y hacia el citosol. Este ciclo de vida contrasta con el de Mycobacterium, que permanece dentro del fagolisosoma (véase, e.g., Clemens, et al. (2002) Infection Immunity 70:5800-5807; Schluter, et al. (1998) Infect. Immunity 66:5930-5938; Gutierrez, et al. (2004) Cell 119:753-766) . El escape de L. monocytogenes del fagolisosoma se media por las proteínas listeriales, tales como listeriolisina (LLO) , PI-PLC, y PC-PLC (véase Portnoy, et al. (2002) J. Cell Biol. 158:409-414) . WO 2004/110481 y WO 2005/071088 se refieren a las vacunas contra el cáncer en base a las cepas de Listeria atenuadas.

Las vacunas para tratar los cánceres o las infecciones frecuentemente son ineficaces debido a la falta de reactivos adecuados. La presente invención cumple esta necesidad al proporcionar polinucleótidos, socios de proteína

de fusión, plásmidos y vacunas bacterianas, útiles para mejorar la expresión o procesamiento inmune de antígenos, y para incrementar la supervivencia a los cánceres e infecciones.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa, en parte, en el reconocimiento de que la administración de Listeria atenuada a un mamífero que tiene un tumor da como resultado la supervivencia mejorada, en donde la Listeria se diseña para contener un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión basada en ActA unida a un antígeno tumoral.

La presente invención de esta manera proporciona un polinucleótido que comprende: (a) un promotor; y (b) un ácido nucleico unido operativamente al promotor, en donde el ácido nucleico codifica una proteína de fusión que comprende: (i) un ActA modificado que comprende al menos los primeros 59 residuos aminoácidos de SEQ ID NO: 38

o SEQ ID NO: 152; y (ii) un antígeno heterólogo. La invención además se define por las reivindicaciones acompañantes. En algunas modalidades, el promotor es un promotor bacteriano (e.g., un promotor Listerial) . En algunas modalidades, el promotor es un promotor ActA. El ActA modificado comprende más de los primeros 59 aminoácidos de ActA, y menos de los primeros 380 aminoácidos de ActA. Por ejemplo, en algunas modalidades, el ActA modificado comprende al menos aproximadamente los primeros 59 aminoácidos de ActA, pero menos de aproximadamente los primeros 265 aminoácidos de ActA. En algunas modalidades, el ActA modificado comprende más de los primeros 59 aminoácidos de ActA, pero menos de aproximadamente los primeros 265 aminoácidos de ActA. En otras modalidades, el ActA modificado comprende más de los primeros 59 aminoácidos de ActA, y menos de los primeros 380 aminoácidos de ActA. En las modalidades todavía adicionales, el ActA modificado comprende al menos los primeros 85 aminoácidos de ActA y menos de los primeros 125 aminoácidos de ActA. En algunas modalidades, el ActA modificado comprende los aminoácidos 1-100 de ActA. En algunas modalidades, el ActA modificado consiste de aminoácidos 1-100 de ActA. El antígeno heterólogo puede ser no-Listerial. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es de, o se deriva de, una célula cancerígena, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es inmunológicamente de reactividad cruzada con, o comparte al menos un epítope con, el cáncer, tumor, o agente infeccioso. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es un antígenotumoral o se deriva de un antígeno tumoral. En algunas modalidades, el antígeno heterólogo es, o se deriva de, mesotelina. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno heterólogo es, o se deriva de, mesotelina humana. En algunas modalidades, la Listeria es hMeso26 o hMeso38 (véase Tabla 11 del Ejemplo VII, de abajo) . En algunas modalidades, el antígeno heterólogo no comprende un péptido antigénico EphA2. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión se optimiza por codón para la expresión en Listeria. La invención proporciona plásmidos y células que comprenden el polinucleótido. La invención además proporciona una bacteria Listeria (e.g., Listeria monocytogenes) que comprende el polinucleótido, así como las vacunas quecomprenden la Listeria. La bacteria Listeria puede atenuarse (e.g., un mutante de supresión actA o un mutante de inserción actA) . En ciertas modalidades, la bacteria puede comprender una mutación en atenuación en actA y/o en inlB. En algunas modalidades, la Listeria comprende el polinucleótido en su genoma.... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido que comprende:

(a) un promotor; y

(b) un ácido nucleico unido operativamente al promotor, en donde el ácido nucleico codifica una proteína de fusión que comprende:

(i) un ActA modificado que comprende al menos los primeros 59 residuos de aminoácido de SEQ ID NO:38 o SEQ ID NO:152, y menos de los primeros 380 aminoácidos de SEQ ID NO:38 o SEQ IDNO:152; y

(ii) un antígeno heterólogo.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, en donde el ActA modificado comprende al menos los primeros 59 a 125 residuos de aminoácido de SEQ ID NO:38 o SEQ ID NO:152.

3. El polinucleótido de la reivindicación 1, en donde el ActA modificado comprende los aminoácidos 1100 de SEQ ID NO:38 o SEQ ID NO:152.

4. El polinucleótido de la reivindicación 1, en donde el ActA modificado comprende la mutación en inactivación en, supresión de, o truncación previa a al menos un dominio seleccionado del grupo que consiste de laregión de homología de cofilina (KKRR) (SEQ ID NO:23) , y el dominio de enlace central de fosfolípido (KVFKKIKDAGKWVRDKI) (SEQ ID NO:20) .

5. El polinucleótido de la reivindicación 4, en donde el ActA modificado comprende todos los cuatro dominios ricos en prolina (FPPPP, FPPPP, FPPPP, FPPIP) (SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22) de ActA.

6. El polinucleótido de la reivindicación 1, en donde el ActA modificado consiste de una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de aminoácidos a ActA-N100 (residuos 1-100 de SEQ ID NO:38) .

7. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el promotor es un promotor actA.

8. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el antígeno heterólogo es de,

o se deriva de, una célula cancerígena, tumor, o agente infeccioso.

9. El polinucleótido de la reivindicación 8, en donde el antígeno heterólogo es mesotelina humana.

10. El polinucleótido de la reivindicación 8, en donde el antígeno heterólogo es un derivado de mesotelina humana que comprende una supresión de su región de péptido de señal, su región de GPI de anclaje, o tanto su péptido de señal como región de GPI de anclaje.

11. El polinucleótido de la reivindicación 8, en donde el antígeno heterólogo es PSCA humano.

12. El polinucleótido de la reivindicación 8, en donde el antígeno heterólogo es un derivado de PSCA humano que comprende una supresión de:

(a) parte o toda su región de péptido de señal;

(b) su región de GPI de anclaje; o

(c) su región de GPI de anclaje y parte o toda su región de péptido de señal.

13. Un plásmido que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Una bacteria Listeria que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

15. La bacteria Listeria de la reivindicación 14, la cual es Listeria monocytogenes.

16. La bacteria Listeria de la reivindicación 15, la cual se atenúa para dispersión de célula a célula y/o entrada en células no fagocíticas.

17. La bacteria Listeria de la reivindicación 16, la cual es un mutante de supresión actA o un mutante de inserción actA.

18. La bacteria Listeria de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en donde la bacteria Listeria comprende el polinucleótido en su genoma.

19. La bacteria Listeria de la reivindicación 18, en donde el polinucleótido se ha integrado en un gen de virulencia en el genoma, en donde la integración del polinucleótido:

(a) interrumpe la expresión del gen de virulencia; o

(b) interrumpe una secuencia codificadora del gen de virulencia.

20. La bacteria Listeria de la reivindicación 19, en donde el gen de virulencia es gen dependiente de prfA, actA o inlB.

21. Una vacuna que comprende la bacteria Listeria de cualquiera de las reivindicaciones 14-20.

. 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212