Evento de maíz MIR162.

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que es única para el evento de maíz MIR162,

donde la secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo constituido por SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 55, SEC ID NO: 59, y sus complemetos.

Evento de Maïz MIR162

Antecedentes La presente invenciïn se refiere generalmente al campo de la biologïa molecular de plantas, a la transformaciïn de las plantas, y a la propagaciïn de las plantas. De manera mïs especïfica, la invenciïn se refiere a plantas de maïz transgïnicas resistentes a los insectos que comprenden un genotipo transgïnico novedoso y a mïtodos para detectar la presencia de ïcidos nucleicos que son ïnicos para las plantas de maïz transgïnicas en una muestra y composiciones de estas.

Las plagas de las plantas constituyen un factor importante en la pïrdida de los cultivos agrïcolas importantes del mundo. Aproximadamente 8 mil millones de dïlares estadounidenses se pierden por aïo solo en los Estados Unidos debido a infestaciones de plagas no mamïferas, que incluyen insectos. Ademïs de estas pïrdidas en los cultivos de los campos, las plagas de insectos tambiïn significan una carga para los cultivadores de vegetales y frutas, los productores de flores decorativas y para los jardineros hogareïos.

Las plagas de insectos se controlan principalmente mediante aplicaciones intensivas de plaguicidas quïmicos, que actïan a travïs de la inhibiciïn del crecimiento de los insectos, la prevenciïn de la alimentaciïn o reproducciïn de los insectos, o causan su muerte. El buen control de los insectos se puede lograr de ese modo pero estos productos quïmicos pueden afectar a veces a otros insectos beneficiosos. Otro problema que resulta del amplio uso de plaguicidas quïmicos es la apariciïn de variedades de insectos resistentes. Este hecho se aliviï parcialmente mediante diversas prïcticas de control de la resistencia, pero existe una creciente necesidad de agentes de control de plagas alternativos. Los agentes de control de plagas biolïgicos, como por ejemplo las cepas de Bacillus thuringiensis (Bt) que expresan toxinas plaguicidas como !-endotoxinas, tambiïn se han aplicado a las plantas de maïz con resultados satisfactorios, ofreciendo una alternativa o un complemento para los plaguicidas quïmicos. Los genes que codifican algunas de estas !-endotoxinas se aislaron y se demostrï que su expresiïn en huïspedes heterïlogos proveïa otra herramienta para el control de plagas de insectos importantes desde eïl punto de vista econïmico. En particular, la expresiïn de las !-endotoxinas de Bt ha provisto una protecciïn eficiente contra plagas de insectos seleccionadas, y las plantas transgïnicas que expresan dichas toxinas se han comercializado, permitiendo a los granjeros reducir las aplicaciones de agentes quïmicos para el control de insectos.

Tambiïn, se identificï otra familia de proteïnas insecticidas producidas por la especie Bacillus durante la etapa de crecimiento vegetativo (proteïnas insecticidas vegetativas (Vip, por sus siglas en inglïs) ) . Las Patentes de Invenciïn estadounidenses nïmeros 5.877.012, 6.107.279, y 6.137.033, describen una nueva clase de proteïnas insecticidas denominadas Vip3. Otras descripciones, incluidas las de los documentos WO 98/18932, WO 98/33991, WO 98/00546, y WO 99/57282, ahora han identificado tambiïn homïlogos de la clase Vip3 de proteïnas. Las secuencias que codifican la Vip3 codifican proteïnas de aproximadamente 88 kDa que poseen actividad insecticida contra un amplio espectro de plagas de lepidïpteros, con inclusiïn, pero sin limitaciïn, del gusano cortador negro (BCW, Agrotis ipsilon) , gusano cogollero (FAW, Spodoptera frugiperda) , gusano de las yemas del tabaco (TBW, Heliothis virescens) , gusano perforador de la caïa de azïcar (SCB, Diatraea saccharalis) , gusano saltarïn perforador del tallo de maïz (LCB, Elasmopalpus lignosellus) , e isoca del maïz (CEW, Helicoverpa zea) , y cuando se expresan en plantas transgïnicas, por ejemplo maïz (Zea mays) , confieren protecciïn a la planta contra el daïo producido por la alimentaciïn de los insectos.

Los mïtodos presentes de transformaciïn de plantas generalmente conducen a la integraciïn aleatoria de trasgenes como vip3 en un genoma de planta huïsped. Esta inserciïn aletoria de ADN introducido en el genoma de la planta puede ser letal si resulta que el ADN extraïo se inserta en un gen nativo esencialmente importante y, de esa manera, hace mutar a dicho gen. Ademïs, incluso si un evento de inserciïn aleatoria no perjudica el funcionamiento de un gen de cïlula huïsped, la expresiïn de un gen extraïo insertado puede ser influenciada por los “efectos de posiciïn” causados por el ADN genïmico circundante. En algunos casos, el gen se inserta en sitios en los que los efectos de la posiciïn son lo suficientemente fuertes para evitar la sïntesis de una cantidad efectiva de producto del gen introducido. Por ejemplo, se ha observado en las plantas que pueden existir amplias variaciones en los niveles de expresiïn de un gen heterïlogo introducido en el cromosoma de una planta entre eventos individualmente seleccionados. Pueden existir tambiïn diferencias en los patrones de expresiïn espaciales o temporales, por ejemplo diferencias en la expresiïn relativa de un transgen en diversos tejidos vegetales, que pueden no corresponder a los patrones esperados de los elementos reguladores transcripcionales presentes en el constructo del gen introducido. En otros casos, la sobreproducciïn del producto gïnico posee efectos perjudiciales sobre la cïlula. Debido a estos problemas potenciales, es comïn producir cientos de diferentes eventos y cribar aquellos eventos para escoger un ïnico evento que posee patrones de expresiïn de transgenes y niveles deseados para fines comerciales. Sin embargo, una vez identificado el sitio comercialmente viable dentro del genoma de una planta, serïa ventajoso dirigir los genes de interïs a ese sitio no perjudicial.

Se han descripto varios mïtodos para la inserciïn dirigida de una secuencia de nucleïtidos de interïs en un sitio cromosïmico especïfico dentro de una cïlula vegetal. Los sistemas de recombinaciïn de sitio especïfico se han identificado en varios organismos procariotas y eucariotas inferiores. Dichos sistemas comprenden generalmente una o mïs proteïnas que reconocen dos copias de una secuencia de nucleïtidos especïfica, escinden y ligan aquellas secencias de nucleïtidos y proveen asï un intercambio de informaciïn genïtica de sitio especïfico preciso. Varias recombinasas de sitio especïfico son conocidas en la tïcnica. Ellas incluyen, pero sin limitaciïn, por ejemplo el sistema del bacteriïfago P1 Cre/lox (Austin et al. (1981) Cell 25: 729-736) , el sistema de recominasa R/RS del plïsmido pSR1 de la levadura Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203) , el sistema Gin/gix del fago Mu (Maeser y Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176) , el sistema de recombinasa FLP/FRT del plïsmido 2 .mu.m de la levadura Saccharomyces cerevisiae (Broach et al. (1982) Cell 29: 227-234) , y la recombinasa Int del bacteriofago Lambda (Landy (1989) Annu. Rev. Biochem. 58: 912-949; Landy (1993) Curr. Opin. Genet. Dev. 3: 699-707; Lorbach et al. (2000) J. Mol. Biol. 296: 1175-1181; y WO 01/16345) . Una estrategia dirigida de sitio especïfico particularmente ïtil, descripta en la Publicaciïn de la Solicitud de Patente de Invenciïn estadounidense No. 2006/0130179, utiliza la recombinaciïn mediada por la integrasa lambda. El mïtodo comprende introducir en una cïlula vegetal una secuencia de nucleïtidos objetivo que comprende un primer Sitio de Reconocimiento de Integrasa; introducir en la cïlula vegetal una secuencia de nucleïtidos donante que comprende un segundo Sitio de Reconocimiento de Integrasa; e introducir en la cïlula vegetal una integrasa o un complejo de integrasa. Otra estrategia dirigida de sitio especïfico ïtil se encuentra descripta en la Publicaciïn de la Solicitud de Patente de Invenciïn No. 2006/0253918, que utiliza la recombinaciïn homïloga para integrar uno o mïs genes (apilamiento de genes) en ubicaciones especïficas en el genoma.

Un evento que posee niveles deseados o patrones de expresiïn de transgenes es ïtil para introgresionar el transgen en otros antecedentes genïticos mediante un cruce exogïmico (“outcrossing”) sexual con el uso de mïtodos de cultivo selectivo convencionales. La progenie de dichos cruces mantiene las caracterïsticas de la expresiïn del transgen del transformante original. Esta estrategia se utiliza para asegurar la expresiïn confiable del gen en una cantidad de variedades que estï bien adaptada a las condiciones de cultivo locales. Asimismo, serïa conveniente poder detectar la presencia de un evento particular a fin de determinar si la progenie de una cruza sexual contiene un transgen de interïs. Ademïs, un mïtodo para detectar un evento particular serïa ïtil para cumplir con las normas que requieren la aprobaciïn percomercial... [Seguir leyendo]

1. Una molïcula de ïcido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleïtidos que es ïnica para el evento de maïz MIR162, donde la secuencia de nucleïtidos se selecciona del grupo constituido por SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 55, SEC ID NO: 59, y sus complemetos.

2. La molïcula de ïcido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicaciïn 1, donde la secuencia de nuclïtidos codifica una porteïna que comprende la SEC ID NO: 2.

3. La molïcula de ïcido nucleico aislada de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, donde la molïcula de ïcido nucleico se encuentra en una semilla de maïz depositada en la American Type Culture Collection bajo el nïmero de acceso PAT-8166.

4. Un par de cebadores de polinucleïtidos que comprende un primer cebador de polinucleïtido y un segundo cebador de polinucleïtido que funcionan juntos en presencia de una plantilla de ADN del evento MIR162 en una muestra para producir un amplicïn diagnïstico para el evento de maïz MIR162, donde el primer cebador de polinucleïtido comprende por lo menos 10 nucleïtidos contiguos de una secuencia de nucleïtidos seleccionada del grupo que comprende los nucleïtidos 1-1088 de la SEC ID NO: 49, los nucleïtidos 9391-10579 de la SEC ID NO: 49 y sus complementos, y donde el segundo cebador de polinucleïtido comprende por lo menos 10 nucleïtidos contiguos de los nucleïtidos 1089-9390 de la SEC ID NO: 49 o sus complementos, y donde dicho evento de maïz MIR162 estï caracterizado por la presencia de la secuencia SEC ID NO: 49 en el genoma del maïz.

5. El par de cebadores de polinucleïtidos de acuerdo con la reivindicaciïn 4, donde el primer cebador de polinucleïtidos se selecciona del grupo que comprende las SEC ID NO: 36, SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 53, SEC ID NO: 58, SEC ID NOs.

6. 72, SEC ID NO: 79, SEC ID NO: 80, SEC ID NOs.

9. 105 y sus complementos, y donde el segundo cebador de polinucleïtidos se selecciona del grupo que comprende SEC ID NOs: 15-35, SEC ID NO: 37, SEC ID NO: 40, SEC ID NOs.

5. 52, SEC ID NO: 54, SEC ID NO: 56, SEC ID NO: 57, SEC ID NO: 63, SEC ID NO: 73, SEC ID NO: 82, SEC ID NO: 96 y sus complementos.

6. Un mïtodo para detectar la presencia de una molïcula de ïcido nucleico que es ïnica para el evento de maïz MIR162 en una muestra que comprende ïcidos nucleicos de maïz, donde el mïtodo comprende:

(a) poner en contacto la muestra con un par de cebadores que, al utilizarse en una reacciïn de amplificaciïn de ïcido nucleico con ADN genïmico del evento de maïz MIR162 produce un amplicïn que es diagnïstico para el evento de maïz MIR162;

(b) realizar una reacciïn de amplificaciïn del ïcido nucleico para producir asï al amplicïn; y

(c) detectar al amplicïn,

donde dicho evento de maïz MIR162 estï caracterizado por la presencia de la secuencia de la SEC ID NO: 49 en el genoma del maïz.

7. Un mïtodo para detectar la presencia de una molïcula de ïcido nucleico que es ïnica para el evento de maïz MIR162 en una muestra que comprende ïcidos nucleicos de maïz, donde el mïtodo comprende:

(a) poner en contacto la muestra con una sonda que se hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad con ADN genïmico del evento de maïz MIR162 y no se hibrida en condiciones de alta rigurosidad con el ADN de la planta de maïz de control;

(b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridaciïn de alta rigurosidad; y

(c) detectar la hibridaciïn de la sonda a la molïcula de ïcido nucleico,

donde dicho evento de maïz MIR162 estï caracterizado por la presencia de la secuencia de la SEC ID NO: 49 en el genoma del maïz.

8. El mïtodo de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7, donde el amplicïn o la sonda comprende una secuencia de nucleïtidos seleccionada del grupo que comprende las SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 55, SEC ID NO: 59 y sus complementos.

9. Un conjunto para detectar ïcidos nucleicos que son ïnicos para el evento de maïz MIR162 que comprende por lo menos una molïcula de ïcido nucleico de suficiente longitud de polinucleïtidos contiguos para funcionar como un cebador o una sonda en un mïtodo de detecciïn de ïcido nucleico, y que ante la amplificaciïn de una secuencia de ïcido nucleico objetivo o una hibridaciïn a una secuencia de ïcido nucleico objetivo en una muestra seguido de la detecciïn del amplicïn o la hibridaciïn a la secuencia objetivo, sirven de diagnïstico para la presencia de secuencias de ïcido nucleico ïnicas para el evento de maïz MIR162 en la muestra, donde dicho evento de maïz MIR162 estï caracterizado por la presencia de la secuencia de la SEC ID NO: 49 en el genoma del maïz.

10. El conjunto de acuerdo con la reivindicaciïn 9, donde la molïcula de ïcido nucleico comprende una secuencia de nucleïtidos de la SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 49.

11. Una planta de maïz transgïnica, o sus cïlulas o tejidos, cada uno de los cuales comprende una molïcula de ïcido 5 nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

12. Una semilla de maïz que comprende una molïcula de ïcido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

13. Una semilla de maïz de acuerdo con la reivindicaciïn 12, donde dicha semilla de maïz es la semilla de maïz depositada en la American Type Culture Collection bajo el nïmero de acceso PTA-8166.

14. Una muestra biolïgica derivada de una planta de maïz, tejido o semilla del evento de maïz MIR162, donde la muestra comprende una secuencia de nucleïtidos que es la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 41, SEC ID

NO: 45, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 55, o SEC ID NO: 59 o complementaria de ïstas y donde la secuencia es detectable en la muestra con el uso de un mïtodo de amplificaciïn de ïcido nucleico o de hibridaciïn de ïcido nucleico.

15. La muestra biolïgica de la reivindicaciïn 14, donde la muestra se selecciona del grupo que comprende harina de maïz, polenta de maïz, jarabe de maïz, aceite de maïz, almidïn de maïz y cereales fabricados total o parcialmente para que contengan subproductos del maïz.

16. Una proteïna insecticida aislada que comprende la SEC ID NO: 2.