Ensayos con nanoetiquetas SERS.

Un método para detectar una molécula de interés que comprende:

proporcionar una perla magnética conjugada a una molécula;

hibridar la perla magnética con una diana complementaria capaz de unirse de manera selectiva a la molécula, incluyendo la diana una porción de biotina;

poner en contacto la perla magnética hibridada con una nanoetiqueta SERS capaz de unirse a la porción de biotina;

separar magnéticamente la perla magnética; y

detectar el espectro Raman de una molécula indicadora Raman asociada con la nanoetiqueta SERS.

Ensayos con nanoetiquetas SERS 5 Campo técnico

[1] La presente invención se dirige hacia un método y sistema para el uso de nanoetiquetas de superficie potenciada para dispersión Raman (nanoetiquetas SERS) para crear una variedad de plataformas de ensayo.

Antecedente de la invención

[2] Las partículas, y las partículas magnéticas en particular, se utilizan ampliamente en ensayos diagnósticos como especies de captura o de detección en fase sólida. Los ensayos basados en micropartículas se pueden dividir en dos categorías principales: ensayos homogéneos (sin separación) y ensayos heterogéneos.

[3] En un formato de ensayo homogéneo (sin separación) los reactivos de unión se mezclan y se miden sin ninguna etapa posterior de lavado antes de la detección. Las ventajas de un sistema de ese tipo son la cinética rápida en fase disolución, un formato de ensayo simple, instrumentación más sencilla así como costes menores debidos a menor número de etapas de ensayo, volúmenes inferiores y menos residuos. Los inmunoensayos en fase homogénea

no necesitan la separación física entre analitos libres y ligados y, por tanto, pueden ser más rápidos y fáciles de llevar a cabo que los inmunoensayos heterogéneos. Los sistemas de inmunoensayos homogéneos utilizan muestras de tamaño más pequeño, un volumen inferior de reactivos y tiempos de incubación más cortos, lo que proporciona un ciclo de trabajo más rápido. Las desventajas de este tipo de ensayos pueden ser un intervalo dinámico y sensibilidad limitados. Puesto que no hay separación de analito libre antes de la detección de la señal, la sensibilidad puede verse

también afectada. Análogamente, las interferencias podrían ocasionar una intensa señal de fondo debida a la interacción entre la muestra y la captura de los reactivos de detección. Los ensayos homogéneos son el formato de ensayo preferido en plataformas de cribado de alto rendimiento tales como ensayos basados en AlphaScreen, SPA, polarización con fluorescencia y citometría de flujo, así como en ensayos diagnósticos tales como los ensayos de aglutinación de partículas usando nefelometría o turbidimetría como métodos de detección.

[4] Los inmunoensayos heterogéneos que requieren la separación de analito libre y detector no unido pueden ser en algunos casos más versátiles que los ensayos homogéneos. Las etapas de lavado o de separación física eliminan la mayoría de sustancias interferentes y, por lo general, no interfieren con la etapa de detección/cuantificación. Los ensayos heterogéneos por etapas son posibles porque permiten un tamaño de muestra más grande, que a su vez

mejora la sensibilidad y proporciona un intervalo dinámico mayor que las curvas de ensayo con patrones convencionales. Las desventajas de los inmunoensayos heterogéneos es que necesitan mucha más mano de obra, requieren tiempo y normalmente necesitan analizadores de uso exclusivo. Además, los sistemas heterogéneos automatizados necesitan diseños más complicados o varios instrumentos para realizar las etapas de lavado y separación. Muchos analizadores clínicos utilizan micropartículas magnéticas en ensayos diagnósticos heterogéneos

para unir selectivamente, y posteriormente separar, el analito de interés de su matriz circundante mediante un campo magnético (The Immunoassay Handbook (21) Nature Publ, Londres). Entre los analizadores basados en este formato se encuentran los instrumentos ACS 18 e Immuno I de Bayer Diagnostics, el instrumento Access de Beckman Coultery el instrumento Elecsys de Roche Diagnostics.

[5] De manera tradicional, solamente se ha utilizado un biomarcador para diagnosticar una enfermedad en ensayos homogéneos tales como los descritos anteriormente: por ejemplo, al antígeno prostático específico (PSA) es el marcador de elección para el cáncer de próstata, incluso aunque tiene poca especificidad (Lu-Yao y col. (23) J Nati Cáncer Inst. 95:1792-1797). Con la llegada de la proteómica, se cree que los ensayos diagnósticos que impliquen varios biomarcadores aumentarán la precisión, especificidad y discernimiento entre diferentes enfermedades que

muestran síntomas similares. El cribado con varios marcadores, como ya se realiza en el campo genómico, proporciona mejor información de diagnóstico y pronóstico que el cribado con un solo marcador. Véase, por ejemplo, Genomic Health's Oncotype Dx Breast Cáncer Assay (25) ( www.genomichealth.com ).

[6] Los ensayos diseñados para acortar el tiempo entre el muestreo y el diagnóstico son también importantes en

escenarios de urgencias o de punto de atención al paciente. Por ejemplo, Biosite Inc. ofrece un inmunoensayo de flujo

tangencial para el diagnóstico y evaluación rápidos de la gravedad de una insuficiencia cardiaca y la estratificación según el riesgo en síndromes coronarios agudos (Biosite Website (25) http://www.biosite.com/products/cardiac.aspx .) Por tanto, se necesitan tecnologías de ensayo más sencillas, más precisas y más rápidas para implementar clínicamente los muchos biomarcadores recientemente identificados en la

investigación proteómica. La capacidad de cuantificartres o más proteínas simultáneamente en un bioensayo rápido sin lavado y sin preparación de la muestra mejoraría de forma importante el estado de la técnica en lo que respecta al diagnóstico o pronóstico de una enfermedad, así como en el seguimiento del progreso de una enfermedad.

[7] La presente invención está dirigida a superar uno o más problemas de los descritos anteriormente.

El documento W247767 describe perlas de polímero activo SERS y un procedimiento para su producción para su uso en la detección de moléculas diana, así como métodos para detectar moléculas diana.

El documento W25113817 proporciona sondas de aptámero, sondas conjugadas de nanopartícula-aptámero, matrices de aptámeros, métodos para detectar analitos diana en una muestra que comprenden detectar la unión de un analito diana a las sondas del aptámero, métodos de detección, y kits.

El documento US6514767 enseña nanopartículas metálicas asociadas a un analito activo en espectroscopia y rodeado por un encapsulante que se describe como útil para etiquetas ópticas sensibles que se pueden detectar mediante espectroscopia de superficie mejorada.

Sumario de la invención

[8] La presente invención proporciona varios métodos y sistemas para el uso de nanoetiquetas de superficie potenciada para dispersión Raman (nanoetiquetas SERS) para crear una variedad de plataformas de ensayo homogéneo, heterogéneo o secuenclal. En determinadas realizaciones, las nanoetiquetas SERS se utilizan junto con partículas magnéticas. También se describen las plataformas de ensayo multiplexadas. En determinadas realizaciones, los ensayos son útiles para proteómica clínica. También se describen plataformas de ensayo adecuadas para su uso en una matriz biológica, por ejemplo, sangre completa o suero. Los formatos de ensayo descritos en el presente documento se pueden utilizar para detectar cualquier analito de interés entre los que se incluyen pero no se ¡Imitan a la detección de células, virus, bacterias, proteínas, ADN, ARN o moléculas pequeñas en cualquier tipo de muestra biológica (del reino animal o vegetal) o ambiental, entre las que se incluyen pero no se limitan sangre completa o suero, muestras desconocidas, orina, heces, aire, agua potable, fagos, cualquier organismo, aglomerados celulares de células, por ejemplo, homogenados de tejido canceroso.

[9] La descripción detallada siguiente incluye las siguientes subsecciones:

A. Una descripción general de las nanoetiquetas SERS para ensayos biológicos.

B. Realizaciones de inmunoensayos de tipo sándwich con anticuerpos de captura asociados a la pared interna de un vial de ensayo.

C. Realizaciones de inmunoensayos de tipo sándwich heterogéneos u homogéneos con partículas de captura magnética.

D. Hibridación de SERS/perlas magnéticas para soportar un ensayo de ADN de tipo SERS magnético.

E. Ensayo competitivo SERS/perlas magnéticas.

F. Ensayos de detección de secuencia.

[1] El uso se partículas para captura magnética en algunos ensayos descritos más adelante permitirá la integración sencilla con los analizadores clínicos existentes. El uso de nanoetiquetas SERS (tal como se describe más adelante) permitirá el uso de un formato de ensayo sin lavado y multiplexado. Es importante resaltar que hay una tendencia emergente de amplio calado en industria hacia la miniaturización, de forma típica mediante el uso de tecnologías de microfluidos y nanofluidos, que también afecta el campo diagnóstico permitiendo la reducción de... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar una molécula de Interés que comprende:

proporcionar una perla magnética conjugada a una molécula;

hibridar la perla magnética con una diana complementaria capaz de unirse de manera selectiva a la molécula, incluyendo la diana una porción de biotina;

poner en contacto la perla magnética hibridada con una nanoetiqueta SERS capaz de unirse a la porción de biotina; separar magnéticamente la perla magnética; y

detectar el espectro Raman de una molécula indicadora Raman asociada con la nanoetiqueta SERS.

2. Un método para detectar una molécula de interés que comprende:

proporcionar una nanoetiqueta SERS conjugada a una molécula;

hibridar la nanoetiqueta SERS con una diana complementaria capaz de unirse de manera selectiva a la molécula, incluyendo la diana una porción de biotina;

poner en contacto la nanoetiqueta SERS hibridada con una partícula magnética capaz de unirse a la porción de biotina;

separar magnéticamente la partícula magnética; y

detectar el espectro Raman de una molécula indicadora Raman asociada con la nanoetiqueta SERS.

3. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, donde la diana es una molécula de ácido nucleico.

4. Un método para detectar una molécula de interés que comprende:

proporcionar una primera nanoetiqueta SERS conjugada a una primera molécula;

proporcionar una segunda nanoetiqueta SERS conjugada con una segunda molécula, donde la segunda nanoetiqueta SERS presenta un espectro Raman diferente del de la primera nanoetiqueta SERS cuando se somete a análisis;

hibridar la primera y segunda nanoetiqueta SERS con una diana complementaria capaz de unirse de manera selectiva a una de la primera y segunda molécula, conteniendo la diana una porción de biotina; poner en contacto la primera y segunda nanoetiqueta SERS hibridada con una partícula magnética capaz de unirse a la porción de biotina;

seleccionar magnéticamente la partícula magnética; y 35 detectar el espectro Raman de una de la primera y segunda nanoetiqueta SERS.

5. El método de la reivindicación 4, donde la primera y la segunda molécula son moléculas de ácido nucleico.