Ensayo de Neisseria gonorrhoeae.

Un procedimiento de detección de una secuencia diana de Neisseria gonorrhoeae que comprende:

(a) en una muestra, amplificar la secuencia diana usando un primer cebador de amplificación que tiene una secuencia que consiste esencialmente en una secuencia de unión a diana de al menos una de SEC ID Nº 1 o 2, en presencia de un cebador adaptador de SEC ID Nº 5; y

(b) detectar la secuencia diana amplificada.

Ensayo de Neisseria gonorrhoeae Campo de la invención La presente invención se refiere a procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos para la detección y/o cuantificación de secuencias de ácidos nucleicos de Neisseria gonorrhoeae.

Antecedentes de la invención La gonorrea es la enfermedad contagiosa más prevalente de la que se tienen datos en Estados Unidos, con unos 2, 5 millones de casos o más comunicados anualmente. Véase Tierney y col., Current Medical Diagnosis and Treatment, 37ª ed., 1998, Appleton & Lange. La gonorrea está provocada por Neisseria gonorrhoeae, una bacteria de tipo diplococos gram-negativa, que se encuentra típicamente dentro de células polimorfonucleares y su forma más común de transmisión es durante el contacto sexual. Estas bacterias pueden infectar el aparato genital, la boca y el recto. En mujeres, la abertura del útero, el cuello uterino, es el primer sitio de infección. El periodo de incubación de la bacteria es habitualmente de 2-8 días (véase Tierney y col., Current Medical Diagnosis and Treatment, 37ª ed., 1998, Appleton & Lange) . La gonorrea es una causa importante de uretitis en hombres y de cervicitis en mujeres. La gonorrea puede extenderse dentro del útero y las trompas de Falopio, lo que tiene como consecuencia una enfermedad inflamatoria pélvica (“PID”) y, de hecho, aproximadamente del 20 % al 40 % de PID y el 14 % de infertilidad tubárica pueden atribuirse a infecciones por gonococos. Véase Chan y col., 2000, Arch. Pathol. Lab. Med. 124:1649-1652.

El diagnóstico de laboratorio tradicional de gonorrea se realiza durante un cultivo durante la noche de exudados clínicos (por ejemplo, orina o exudado cervical) obtenidos del sujeto, seguido por identificación bioquímica y/o al microcopio de Neisseria gonorrhoeae.

Recientemente, se han usado extensamente ensayos de amplificación de ácidos nucleicos para la detección y/o el diagnóstico. Los ensayos de amplificación de ADN de Neisseria gonorrhoeae disponibles actualmente en el comercio incluyen PCR (Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ) y amplificación por desplazamiento de cadena (SDA; Becton Dickinson, Sparks, MD) . Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos in vitro proporcionan herramientas útiles para la detección y el análisis de ácidos nucleicos, especialmente cuando los ácidos nucleicos diana están presentes en pequeñas cantidades. La sensibilidad de dichos procedimientos los ha hecho particularmente adecuados en áreas tales como diagnostico médico (por ejemplo, detección de agentes infecciosos como bacterias y virus, diagnóstico de enfermedades genéticas hereditarias y adquiridas y el establecimiento del tipo de tejido) , aislamiento de genes y medicina forense (por ejemplo, ensayos forenses de detección de ácidos nucleicos específicos en investigación de delitos) .

Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos se clasifican tradicionalmente según los requerimientos de temperatura en el procedimiento de amplificación. Las amplificaciones isotérmicas se realizan a una temperatura constante, a diferencia de amplificaciones que requieren una alternancia entre ciclos de temperaturas altas y bajas. Los ejemplos de técnicas de amplificación isotérmicas son: Amplificación por desplazamiento de cadena (SDA; Walker y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396; Walker y col., 1992, Nuc. Acids. Res. 20:1691-1696; y el documento EP 0 497 272) , replicación de secuencia autosostenida (3SR; Guatelli y col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878) , el sistema de Qβreplicasa (Lizardi y col., 1988, BioTechnology 6:1197-1202) , y las técnicas divulgadas en los documentos WO 90/10064 y WO 91/03573. Ejemplos de técnicas que requieren ciclos de temperatura son: reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Saiki y col., 1985, Science 230:1350-1354) , reacción en cadena de la ligasa (LCR; Wu y col., 1989, Genomics 4:560-569; Barringer y col., 1990, Gene 89:117-122; Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193) , amplificación basada en la transcripción (Kwoh y col., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177) y amplificación mediante restricción (patente de Estados Unidos Nº 5.102.784) .

Los ensayos de amplificación de ácidos nucleicos disponibles actualmente para Neisseria gonorrhoea, no obstante, carecen de mecanismos de control internos para determinar cualesquiera condiciones de reacción inhibidoras o errores humanos que tengan lugar en los ensayos y tiendan, por lo tanto, a proporcionar resultados negativos falsos. Por lo tanto, existe la necesidad de un ensayo que reduzca la posibilidad de obtener resultados negativos falsos.

La Neisseria gonorrhoeae comparte un alto grado de homología con otras especies de Neisseria estrechamente relacionadas. Por lo tanto, existe claramente la necesidad de desarrollar nuevos procedimientos y oligonucleóticos que sean capaces de confirmar los resultados de ensayos existentes y/o aumentar la especificidad y/o la sensibilidad de un ensayo para detectar Neisseria gonorrhoeae.

La presente invención proporciona un ensayo de amplificación de ácidos nucleicos dúplex que pueden usarse como alternativa al ensayo monoplex de Neisseria gonorrhoeae actuales (es decir, sin control de amplificación interno en la misma mezcla de reacción con una secuencia diana) . La presente divulgación también proporciona oligonucleótidos que pueden usarse en ensayos de amplificación de ácidos nucleicos tanto dúplex como monoplex diseñados para amplificar y/o detectar ácidos nucleicos de Neisseria gonorrhoeae.

La mención o la discusión de una referencia en el presente documento no se construirán como la aceptación de que la misma es de la técnica anterior con respecto a la presente invención.

Sumario de la invención La presente invención proporciona un procedimiento para detectar cualitativa y/o cuantitativamente la presencia o la ausencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento: (a) en una muestra, amplificar la secuencia diana usando un primer cebador de amplificación que tiene una secuencia que consiste esencialmente en una secuencia de unión a diana de al menos una de SEC ID Nº 1 o 2, en presencia de un cebador adaptador de SEC ID Nº 5; y (b) detectar la secuencia diana amplificada. En el procedimiento anterior puede usarse un segundo cebador de amplificación que consiste esencialmente en la secuencia de unión a diana de cualquier cebador de amplificación que se divulgue en el presente documento.

La presente invención también proporciona un procedimiento para detectar una secuencia diana de Neisseria gonorrhoeae que comprende: (a) hibridar uno o más cebadores de amplificación que tienen una secuencia que consiste esencialmente en la secuencia de unión a diana de SEC ID Nº 1 o 2 en presencia de un control de amplificación interno que consiste esencialmente en SEC ID Nº 9 o 19 y un cebador adaptador que consiste en SEC ID Nº 5, y amplificar dicho control de amplificación interno y (b) detectar al menos uno de dicho cebador de amplificación y dicho control de amplificación interno.

Descripción detallada de la invención Cualesquiera definiciones proporcionadas son por motivos de claridad y no deberán considerarse como limitantes. A menos de que se indique, los términos técnicos y científicos que se usan en el presente documento tienen los mismos significados que se entienden comúnmente por parte de los expertos en la técnica a la que pertenece la presente invención.

La presente invención se refiere a procedimientos y ensayos de amplificación de ácidos nucleicos para la detección y/o cuantificación de secuencias de ácidos nucleicos de Neisseria gonorrhoeae. La presente divulgación proporciona uno o más oligonucleóticos que son complementarios o que se alinean a secuencias de ácidos nucleicos de Neisseria gonorrhoeae para la amplificación y/o detección de dichas secuencias. La presente invención proporciona adicionalmente un control de amplificación interno (IAC) que puede usarse en ensayos de amplificación de ácidos nucleicos de la invención para determinar si las condiciones de ensayo son permisibles para la amplificación y/o la detección de una secuencia diana. Los oligonucleóticos pueden usarse en todos los tipos de reacciones de amplificación tales como, por ejemplo, amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) , reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , reacción en cadena de la ligasa, amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) , amplificación por círculo rodante (RCA) , amplificación mediada por transcripción (TMA) y amplificación mediada por QB replicasa.

Los procedimientos de la invención son particularmente ventajosos con respecto... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de detección de una secuencia diana de Neisseria gonorrhoeae que comprende:

(a) en una muestra, amplificar la secuencia diana usando un primer cebador de amplificación que tiene una secuencia que consiste esencialmente en una secuencia de unión a diana de al menos una de SEC ID Nº 1 o 2, 5 en presencia de un cebador adaptador de SEC ID Nº 5; y

(b) detectar la secuencia diana amplificada.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 que además comprende un segundo cebador de amplificación que tiene una secuencia que consiste esencialmente en al secuencia de unión a diana de SEC ID Nº 1 o 2.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que

(a) el primer cebador de amplificación consiste esencialmente en una secuencia de unión a diana de SEC ID Nº 1, y

(b) el segundo cebador de amplificación consiste esencialmente en una secuencia de unión a diana de SEC ID Nº

2.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha reacción de amplificación es seleccionada del grupo que consiste en detección directa, reacción de amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) , reacción de cadena de la polimerasa (PCR) , hibridación in situ, amplificación mediada por transcripción (TMA) , replicación de secuencia autosostenida (SSR) , amplificación por círculo rodante o amplificación basada en secuencias de aminoácidos (NASBA) .

5. Un procedimiento de detección de una secuencia diana de Neisseria gonorrhoeae que comprende:

(a) hibridar uno o más cebadores de amplificación que tienen una secuencia que consiste esencialmente en la secuencia de unión a diana de SEC ID Nº 1 o 2 en presencia de un control de amplificación interno que consiste esencialmente en SEC ID Nº 9 o 19 y un cebador adaptador que consiste en SEC ID Nº 5, y amplificar dicho control de amplificación interno y

(b) detectar al menos uno de dicho cebador de amplificación y dicho control de amplificación interno.