Dispositivo y métodos de ensayo.

Un dispositivo de ensayo para detectar la presencia o cantidad de un analito que reside en una muestra acuosa,

el dispositivo comprende:

(i) al menos un área de aplicación adecuada para la aplicación de una muestra acuosa al dispositivo;

(ii) al menos un sonda, reportero o reactivo en donde, en uso la al menos una sonda, reportero o reactivo es capaz de reaccionar con un analito que reside en la muestra acuosa;

(iii) al menos un área de prueba en donde, en uso puede determinarse el resultado y/o progreso de una reacción entre el analito y la al menos una sonda, reportero o reactivo;

(iv) al menos una vía de flujo que está en comunicación continua con el al menos un área de aplicación y el al menos un área de prueba,

caracterizado porque la al menos una vía de flujo se recubre con al menos un polímero anfipático que es soluble en agua y en donde, en uso el paso del fluido a lo largo de la al menos una vía de flujo es mayor que el esperado por la acción capilar sola.

Dispositivo y métodos de ensayo Campo de la invención La presente invención se relaciona con el uso de polímeros anfipáticos para mejorar el flujo lateral y la mezcla de los reactivos en los dispositivos de ensayo. Más específicamente, la invención se relaciona con el uso de un polímero anfipático en métodos de ensayo que incluyen un dispositivo para la determinación de la concentración de lípidos en el suero o el plasma de la sangre.

Antecedentes de la invención Los dispositivos y los métodos de ensayo de flujo lateral se conocen en la técnica. Los dispositivos de la técnica anterior incluyen los que se muestran en el documento WO 01/47637, que describe un dispositivo de ensayo que comprende una vía de flujo hacia la superficie a la cual está unido un polímero no iónico hidrofílico. Anteriormente, dichos dispositivos se han desarrollado para muestras de prueba que están fácilmente disponibles en grandes cantidades. Sin embargo, cuando la muestra de prueba es sangre o un componente de la sangre, la recolección de una muestra grande no siempre es posible, particularmente en un punto de asistencia tal como la consulta de un médico.

Generalmente estos dispositivos comprenden una matriz de flujo lateral, por ejemplo, membranas de nitrocelulosa y similares. Una muestra aplicada a la matriz fluye a lo largo de la matriz, y uno o más analitos dentro de la muestra reaccionan con uno o más reactivos dentro de la matriz de flujo lateral. Típicamente, al menos uno de estos reactivos está inmovilizado dentro de la matriz lo que permite detectar cualquier reacción con los analitos, por ejemplo, visualmente.

Desafortunadamente, las variaciones asociadas con la transferencia de la muestra y la difusión de la muestra a la membrana resulta en un flujo que es en gran medida incontrolado e irregular antes de alcanzar el área de prueba. Esto se debe a que dichos dispositivos se basan sólo en la acción capilar de los fluidos. Tal dependencia de la acción capilar puede tener un efecto adverso sobre la exactitud del dispositivo debido a que la cantidad de analito y/o marcador capturado a través de un área de prueba no es consistente. El uso de la acción capilar sola significa además que los ensayos son lentos debido a la poco confiable absorción por capilaridad del fluido. Los ensayos son además inadecuados para muestras de fluido pequeñas, tal como en la detección de ácidos nucleicos, donde la membrana puede secarse antes de que el ensayo esté completo o el fluido puede ser insuficiente para desplazarse por la longitud del dispositivo de prueba.

Como tal, actualmente existe la necesidad de una técnica simple y eficiente para mejorar los ensayos de flujo lateral, 35 particularmente para permitir la prueba más rápida a la vez que permite realizar pruebas de pequeño volumen.

Un área donde los dispositivos de flujo lateral para puntos de asistencia serían útiles es en el campo de las pruebas del colesterol y lípidos en la sangre.

Es bien conocido que la concentración de varias lipoproteínas en la sangre se correlaciona con el riesgo de un individuo de desarrollar aterosclerosis. La aterosclerosis es una enfermedad que afecta los vasos sanguíneos de las arterias y se refiere comúnmente como un "endurecimiento" o "revestimiento" de las arterias. Es provocada por la formación de múltiples placas sobre las paredes de los vasos sanguíneos, en gran parte debido a la acumulación de células blancas macrófagas de la sangre y promovida por las lipoproteínas de baja densidad. Sin la eliminación adecuada de las grasas y el colesterol de los 45 macrófagos por las lipoproteínas de alta densidad (HDL) , se desarrolla una respuesta inflamatoria crónica en las paredes de las arterias.

La mayor parte del colesterol circulante en el plasma de la sangre se encuentra en tres clases principales de lipoproteínas. El colesterol y los ésteres de colesterol son sustancias insolubles en agua y por ello son transportados por estas 50 lipoproteínas dentro del sistema circulatorio para su utilización eventual por las células del cuerpo.

Cada una de estas clases de lipoproteínas transporta cantidades variables de colesterol. El colesterol total del suero es por ello un promedio complejo de la cantidad que aporta cada clase de lipoproteína a la concentración total de lipoproteínas del suero.

Cada clase de lipoproteína juega un papel diferente en la aterosclerosis. Las lipoproteínas de alta densidad o HDL se consideran generalmente como 'colesterol bueno', es decir que son anti-aterogénicas. En contraste, las lipoproteínas de baja densidad o LDL se refieren frecuentemente como 'colesterol malo' dado que se conoce que son altamente aterogénicas. Otra clase de lipoproteínas, las lipoproteínas de muy baja densidad o VLDL se consideran ligeramente 60 aterogénicas.

Los niveles de HDL en la sangre se han investigado extensamente en vista de la relación inversa entre el colesterol HDL y el riesgo de aterosclerosis y, por ejemplo, ataque al corazón. Por lo tanto, si se determina que los niveles de colesterol HDL son bajos, un individuo puede tener un mayor riesgo de desarrollar aterosclerosis. Por ello, este riesgo puede estimarse al ensayar el colesterol HDL. A partir de los resultados de este ensayo puede calcularse una cantidad aproximada de colesterol LDL mediante el uso de la siguiente ecuación:

Colesterol LDL=Colesterol Total -1/5 Colesterol Total -colesterol HDL

Para determinar el contenido de colesterol de las diversas fracciones de colesterol, se usan generalmente cuatro métodos. Estos incluyen (1) ultracentrifugación, (2) precipitación fraccionada, (3) cálculo mediante el uso de la ecuación de Friedewald y (4) separación electroforética y precipitación.

Cada uno de estos métodos tiene una serie de desventajas. Por ejemplo, la ultracentrifugación requiere el uso de equipamiento de laboratorio especializado y puede tomar varios días para completarse. La precipitación fraccionada y la separación electroforética consumen tiempo y también requieren el uso de equipamiento especializado. La ecuación de Friedewald es inexacta debido a que estima la concentración del colesterol LDL mediante la sustracción del colesterol asociado con otras clases de lipoproteínas. Por lo tanto, la ecuación proporciona una estimación indirecta sobre la base de tres análisis de lípidos independientes cada uno de los cuales proporciona una fuente potencial de error.

Como resultado de estas desventajas, los resultados de los ensayos de colesterol no están disponibles por varias horas o incluso días y no pueden realizarse en laboratorios más pequeños o por médicos en sus consultas. En consecuencia existe la necesidad de un dispositivo y un método para realizar un ensayo de colesterol que sea simple y barato de usar. Además existe la necesidad de un ensayo que mida directamente la concentración de cada clase de lipoproteína sin depender de estimaciones indirectas.

Cuando se adicionan moléculas hidrofóbicas sólidas a una solución o suspensión acuosa estas forman un precipitado inmediato y no entran a la fase acuosa debido a que las moléculas hidrofóbicas se 'pegan' entre sí en lugar de disolverse. Incluso con la agitación vigorosa del precipitado el número de encuentros directos entre las moléculas hidrofóbicas y las moléculas en solución es pequeño. Tales interacciones también pueden ser termodinámicamente desfavorables.

Los métodos de la técnica anterior implican disolver las moléculas hidrofóbicas en solventes orgánicos miscibles en agua adecuados antes de mezclar con una solución o suspensión acuosa. En su entrada a la solución acuosa, las moléculas hidrofóbicas están mono-dispersas y por ello tienen una mayor probabilidad de interactuar con las moléculas que ya están en solución. Sin embargo, dichos métodos tienen la desventaja de que el solvente orgánico es frecuentemente tóxico o puede interferir con reacciones enzimáticas o la medición de la fluorescencia. Dichos métodos generalmente no son adecuados además para el uso en un punto de asistencia tal como la consulta de un médico o clínica.

Resumen de la invención Los solicitantes han hecho el sorprendente descubrimiento de que mediante el uso de polímeros anfipáticos en un sistema de ensayo, pueden lograrse ganancias considerables en la eficiencia y/o la velocidad del ensayo. Los métodos de los solicitantes son aplicables además para combinar rápidamente reactivos y compuestos hidrofóbicos tales como luminóforos con analitos, por ejemplo lipoproteínas, en solución (s) /suspensión (s) acuosa (s) sin la aplicación directa de solventes orgánicos. Este método permite cuantificar fácilmente el contenido de lipoproteínas de la sangre,... [Seguir leyendo]

1. Un dispositivo de ensayo para detectar la presencia o cantidad de un analito que reside en una muestra acuosa, el dispositivo comprende:

(i) al menos un área de aplicación adecuada para la aplicación de una muestra acuosa al dispositivo;

(ii) al menos un sonda, reportero o reactivo en donde, en uso la al menos una sonda, reportero o reactivo es capaz de reaccionar con un analito que reside en la muestra acuosa;

(iii) al menos un área de prueba en donde, en uso puede determinarse el resultado y/o progreso de una 10 reacción entre el analito y la al menos una sonda, reportero o reactivo;

(iv) al menos una vía de flujo que está en comunicación continua con el al menos un área de aplicación y el al menos un área de prueba, caracterizado porque la al menos una vía de flujo se recubre con al menos un polímero anfipático que es soluble en agua y en donde, en uso el paso del fluido a lo largo de la al menos una vía de flujo es mayor que el esperado por la acción capilar sola.

2. El dispositivo de la reivindicación 1 en donde el polímero anfipático se imprime y/o se rocía sobre una superficie del dispositivo.

3. El dispositivo de la reivindicación 2 en donde el polímero anfipático forma uno o más conjuntos de gotitas en nano litro, pico litro o femto litro.

4. El dispositivo de cualquier reivindicación precedente en donde la al menos una vía de flujo comprende la al menos una sonda, reportero o reactivo.

5. El dispositivo de la reivindicación 4 en donde la al menos una sonda, reportero o reactivo se combinan con el polímero anfipático.

6. El dispositivo de la reivindicación 4 en donde la al menos una sonda, reportero o reactivo se disponen por encima, 30 por debajo o al lado del polímero anfipático.

7. El dispositivo de la reivindicación 1 en donde el resultado y/o progreso de una reacción se determina por medio de un ensayo fluorimétrico.

8. El dispositivo de la reivindicación 7 en donde el dispositivo comprende al menos dos componentes separables.

9. El dispositivo de la reivindicación 8 en donde los al menos dos componentes separables son un lector y un cartucho de prueba.

10. El dispositivo de la reivindicación 9 en donde cartucho de prueba comprende la al menos una vía de flujo.

11. El dispositivo de la reivindicación 1 en donde la reacción es un inmunoensayo.

12. El dispositivo de la reivindicación 11 en donde la reacción es un ELISA.

13. El dispositivo de la reivindicación 7 en donde el ensayo fluorimétrico es un ensayo de colesterol, un ensayo de lipoproteínas o un ensayo de triglicéridos.

14. El dispositivo de la reivindicación 1 en donde la al menos una sonda, reportero o reactivo se selecciona a partir de

un grupo que consiste en Amplex Rojo, K37, Rojo del Nilo, colesterol esterasa, colesterol oxidasa o peroxidasa de rábano picante.

15. El dispositivo de cualquier reivindicación precedente en donde la al menos una sonda, reportero o reactivo está en forma seca.

16. El dispositivo de la reivindicación 15 en donde la al menos una sonda, reportero o reactivo comprende un agente estabilizante.

17. El dispositivo de cualquier reivindicación precedente en donde el polímero anfipático es polietilenglicol (PEG) .

18. El dispositivo de la reivindicación 17 en donde el polímero anfipático es polietilenglicol con un peso molecular de 5 1000 Da a 20, 000 Da.

19. Un proceso para mejorar el flujo lateral del fluido en un dispositivo libre de membrana para el uso en puntos de asistencia que comprende una superficie a lo largo de la que un fluido puede fluir con un polímero anfipático que es soluble en agua.