Vectorización de ARN bicatenario por partículas catiónicas y su utilización tópica.

Composición tópica u ocular que comprende al menos un oligonucleótido de ARN bicatenario,

caracterizada porque el oligonucleótido de ARN bicatenario se adhiere a la superficie de al menos una partícula catiónica de untamaño inferior o igual a 1 μm, de potencial zeta comprendido entre 10 y 80 mV, comprendiendo dicha partícula almenos un tensioactivo catiónico y siendo seleccionada entre las micelas de tensioactivos y las micelas de polímerosbloques, siendo dicho tensioactivo catiónico seleccionado entre las sales de amonio cuaternario.

Vectorización de ARN bicatenario por partículas catiónicas y su utilización tópica La presente invención se refiere a la vectorización de dsARN por partículas catiónicas seleccionadas entre micelas de tensioactivos y micelas de polímeros bloques, así como a unas composiciones tópicas para la piel, las mucosas y los ojos que comprende la asociación de al menos un dsARN y de al menos una partícula catiónica.

Se busca la utilización de sustancias que presentan una actividad específica, tal como una actividad biológica específica, en el campo cosmético tal como el cuidado de la piel o el cuidado capilar, pero también en los campos dermatológicos y farmacéuticos.

Desde hace poco tiempo, la utilización de dsARN y más particularmente de siARN (de 12 a 40 nucleótidos) permite obtener una actividad de inhibición específica de la síntesis de una proteína diana.

El mecanismo molecular utilizado hace intervenir unos fragmentos de ARN bicatenario constituidos por 12 a 40 nucleótidos. La degradación del ARNm diana se obtiene mediante la activación del complejo RISC (RNA Induced Silencing Complex) efectiva por la fijación de la hebra antisentido de dsARN sobre el ARNm. Estos oligonucleótidos de ARN bicatenario, se denominan también dsARN o también siARN (por "short interfering" RNA) , véase Tuschl T. Chem. Biochem. 2001; 2: 239-245, Nykanen A et al. Cell 2001 107 309-321, Dorsett Y. Nature, abril de 2004, Vol. 3, páginas 318-329 y Downward J. BMJ 2004, 328, 1245-1248.

Sin embargo, el problema de la penetración durante la aplicación tópica de estos siARN, cuyo peso molecular puede ser de aproximadamente 15-17 kD, se plantea y pide ser optimizado. En efecto, para que la actividad específica relativa al siARN seleccionada sea efectiva, es necesario que ésta penetre en la célula diana (por ejemplo los queratinocitos o los melanocitos, etc.) hasta en su citoplasma. Ahora bien, el estrato córneo, sede de la función de barrera cutánea, es difícil de penetrar. Por lo tanto se necesita buscar una solución que permita la penetración de siARN en la piel.

De manera inesperada, la solicitante ha constatado que la asociación de siARN con partículas catiónicas permite mejorar muy significativamente su penetración en las células dianas de un tejido tal como la piel. Una vez penetrado, el siARN se vuelve activo por su fijación sobre el RISC. La penetración se puede evaluar con la ayuda de un marcador fluorescente fijado sobre el siARN y su actividad por la cuantificación del mensajero diana por PCR cuantitativa o por dosificación de la proteína correspondiente al mensajero diana. Las partículas catiónicas de la invención pueden ser unas micelas de tensioactivos o unas micelas de polímeros bloques. De manera general, el tamaño medio de las partículas de la invención debe ser menor que el micrómetro.

La solicitud WO 03/101376 describe unas composiciones cosméticas que comprenden al menos un oligonucleótido de ARN bicatenario. En esta solicitud, el oligonucleótido está necesariamente complejado con un polímero catiónico, como por ejemplo la PEI o el quitosano, pudiendo este complejo oligonucleótido-polímero catiónico ser encapsulado a continuación en liposomas o niosomas y/o ser adsorbido en la superficie de partículas tales como los liposomas, niosomas, oleosomas, nanoesferas y nanocápsulas.

Así, en este documento, el dsARN está necesariamente complejado con un polímero catiónico antes de ser asociado a un tipo de partícula.

Además, las micelas de tensioactivos no están descritas como solución galénica efectiva para la vectorización de siARN.

En el artículo: Intercellular adhesion molecule-1 suppression in skin by topical deliver y of anti-sense oligonucleotides de Mehta et al. (J. Invest. Dermatol 115:805-812, 2000) , los autores vehiculan ADN monocatenario en una emulsión que contiene 25% de tensioactivos (10% de estearato de glicerilo y 15% de estearato 40 EO) . Además del hecho de que este artículo no describe los siARN, la solución galénica propuesta no es compatible con una buena tolerancia cutánea. En efecto, el 25% de los tensioactivos tendrán como efecto destruir la función de barrera de la piel, aumentando así su permeabilidad a los elementos exteriores y favoreciendo dramáticamente su deshidratación: resultados que no se buscan en los campos de aplicación considerados por la presente invención.

En la publicación: lipidic carriers of siRNA: differences in the formulation, cell uptake and deliver y with plasmid DNA de Spagnou et al. (Biochemistr y , 43:13348-56, 2004) , los autores utilizan unos liposomas catiónicos tales como la lipofectamina 2000 o liposomas de DOPE "cationizados" con colesteriloxicarbonil3-7-diazanonano 1-9 diamina (CDAN) . Por razones de inocuidad, la lipofectamina no se puede utilizar sobre la piel humana y se buscaránn soluciones más fáciles de realizar y económicamente compatibles con la comercialización del producto.

Otras publicaciones (Yano Junichi et al. Clinical Cancer Research, 2004, Spagnou et al. Biochemistr y , 2004, y Ma Zheng et al. Biochemical and Biophysical Research Communication, 2004) han propuesto asociar unos siARN con vesículas catiónicas constituidas por lípidos de cadenas oleilos que comprenden unas insaturaciones que los hacen muy sensibles a la oxidación, y por fosfolípidos, estando estas vesículas destinadas a ser utilizadas inmediatamente después de la preparación ya que no son estables en el tiempo.

La solicitud de patente WO 2004/046354 describe la utilización de siARN para las disfunciones cutáneas y preferiblemente a nivel de la dermis. Las composiciones descritas tales como los PIT, las emulsiones W/O, O/W y W/O/W son todas no iónicas. No se tiene en cuenta en esta solicitud de patente el interés principal y esencial de utilizar tensioactivos catiónicos en partículas catiónicas para favorecer la penetración de los siARN en las estructuras cutáneas. Por otra parte, si los PIT pueden ser inferiores al !m, estos son necesariamente no iónicos, como se describe en la patente WO 96/28132.

El documento WO 03/106636 describe la asociación de un polinucleótido con un tensioactivo catiónico tal como el cloruro de cetil-tri-amonio para formar un complejo. Es necesario a continuación estabilizar este complejo mediante una etapa de incubación a una temperatura comprendida entre 35 y 50ºC.

En un segundo tiempo, es posible deshidratar la mezcla para obtener un polvo que se diluirá después en un disolvente seleccionado, antes del uso (inyección) . Es posible asimismo, una vez formado el complejo, estabilizarlo mediante la adición de un lípido anfífilo que puede ser un tensioactivo no iónico. Esta asociación ternaria se deshidrata después para obtener un polvo que será diluido después en una disolución acuosa adaptada.

La solicitud WO 03/106636 no precisa que sea necesario situarse por encima de la CMC (Concentración Micelar Crítica) del tensioactivo para formar el complejo polinucleótido/tensioactivo catiónico, pudiendo el complejo formarse por debajo de la CMC. Una vez que este complejo esta formado, es cuando se considera la adición de otro compuesto anfífilo que podrá formar unas micelas. Así, se obtiene la integración de un complejo polinucleótido/tensioactivo catiónico en micelas de anfífilos.

Así, en este documento, no se habla de asociar unas partículas catiónicas a un polinucleótido.

Así, la presente solicitud describe en primer lugar una composición tópica u ocular que comprende al menos un oligonucleótido de ARN bicatenario, caracterizada por que el oligonucleótido de ARN bicatenario está asociado a al menos una partícula catiónica de un tamaño menor o igual que 1 !m, de potencial zeta comprendido entre 10 y 80 mV seleccionada entre las micelas de tensioactivos, en particular las micelas de tensioactivos anfífilos no iónicos y de tensioactivos catiónicos, las micelas de polímeros bloques, en particular las micelas de polímero bloque anfífilo catiónico, las micelas de polímero bloque anfífilo no iónico y de polímero bloque anfífilo catiónico, y las micelas de polímero bloque anfífilo no iónico y de tensioactivo catiónico.

Por composición tópica, se entiende una composición adaptada a la aplicación sobre la superficie del cuerpo, es decir la piel, los faneros, las mucosas y ojos La presente invención se refiere a la asociación de partículas catiónicas con al menos un dsARN que se adherirá a la superficie de la partícula, sirviendo ésta de vehículo para hacerlo penetrar en las estructuras cutáneas y en las células dianas de la piel, de las mucosas o también de los ojos para aplicaciones cosméticas, dermatológicas y/o oftálmicas.

Las... [Seguir leyendo]

1. Composición tópica u ocular que comprende al menos un oligonucleótido de ARN bicatenario, caracterizada por que el oligonucleótido de ARN bicatenario se adhiere a la superficie de al menos una partícula catiónica de un tamaño inferior o igual a 1 !m, de potencial zeta comprendido entre 10 y 80 mV, comprendiendo dicha partícula al

menos un tensioactivo catiónico y siendo seleccionada entre las micelas de tensioactivos y las micelas de polímeros bloques, siendo dicho tensioactivo catiónico seleccionado entre las sales de amonio cuaternario.

2. Composición según la reivindicación 1, caracterizada por que la partícula catiónica tiene un tamaño inferior o igual a 500 nm.

3. Composición según la reivindicación 1 o 2, caracterizada por que la partícula catiónica tiene un tamaño inferior o 10 igual a 300 nm.

4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que la partícula catiónica es una micela de tensioactivos anfífilos no iónicos y de tensioactivos catiónicos.

5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que la micela de polímero bloque

se selecciona entre una micela de polímero bloque anfífilo catiónico, una micela de polímero bloque anfífilo no iónico 15 y de polímero bloque anfífilo catiónico y una micela de polímero bloque anfífilo no iónico y de tensioactivo catiónico.

6. Composición según la reivindicación 1, caracterizada por que dicha sal de amonio cuaternario se selecciona entre:

-las sales de amonio cuaternario de fórmula general (IV) siguiente:

(IV)

en la que los radicales R1 a R4, idénticos o diferentes, representan un radical alifático, lineal o ramificado, seleccionado entre los radicales alquilo, alcoxi, alquilamida o hidroxialquilo que comprenden de 1 a 30 átomos de carbono, los radicales polioxialquileno (C2-C6) , alquil (C12-C22) amido alquil (C2-C6) , alquil (C12-C22) acetato; y X es un anión seleccionado en el grupo de los halogenuros, fosfatos, acetatos, lactatos, alquil (C2-C6) sulfatos, alquil- o alquilarilsulfonatos.

- las sales de amonio cuaternario del imidazolinio,

-las sales de diamonio cuaternario de fórmula (VI) :

(VI)

en la que R9 designa un radical alifático que comprende aproximadamente de 16 a 30 átomos de carbono, R10, R11, R12, R13 y R14, idénticos o diferentes, se seleccionan entre el hidrógeno o un radical alquilo que comprende de 1 a 4 átomos de carbono, y X es un anión seleccionado en el grupo de los halogenuros, acetatos, fosfatos, nitratos y metilsulfatos,

-las sales de amonio cuaternario que contienen al menos una función éster.

7. Composición según la reivindicación 1, caracterizada por que dicha sal de amonio cuaternario se selecciona entre las sales de amonio cuaternario de fórmula general (IV) siguiente:

(IV)

en la que los radicales R1 a R4, idénticos o diferentes, representan un radical alifático, lineal o ramificado, seleccionado entre los radicales alquilo, alcoxi, alquilamida o hidroxialquilo que comprenden de 1 a 30 átomos de carbono, los radicales polioxialquileno (C2-C6) , alquil (C12-C22) amido alquilo (C2-C6) , o alquil (C12-C22) acetato; y X es un anión seleccionado en el grupo de los halogenuros, fosfatos, acetatos, lactatos, alquil (C2-C6) sulfatos, alquil- o alquilarilsulfonatos.

8. Utilización tópica u ocular de una composición que comprende al menos un oligonucleótido de ARN bicatenario, caracterizada por que el oligonucleótido de ARN bicatenario se adhiere a la superficie de al menos una partícula catiónica de un tamaño inferior o igual a 1 !m, de potencial zeta comprendido entre 10 y 80 mV, comprendiendo dicha partícula al menos un tensioactivo catiónico y siendo seleccionada entre las micelas de tensioactivos y las micelas de polímeros bloques con fines cosméticos, siendo dicho tensioactivo catiónico seleccionado entre las sales de amonio cuaternario.

9. Utilización según la reivindicación 8, caracterizada por que la partícula catiónica tiene un tamaño inferior o igual a 10 500 nm o 300 nm.

10. Utilización según la reivindicación 8, caracterizada por que dicha sal de amonio cuaternario se selecciona entre:

-las sales de amonio cuaternario de fórmula general (IV) siguiente:

(IV)

en la que los radicales R1 a R4, idénticos o diferentes, representan un radical alifático, lineal o ramificado,

seleccionado entre los radicales alquilo, alcoxi, alquilamida o hidroxialquilo que comprenden de 1 a 30 átomos de carbono, los radicales polioxialquileno (C2-C6) , alquil (C12-C22) amido alquilo (C2-C6) , alquil (C12-C22) acetato; y X es un anión seleccionado en el grupo de los halogenuros, fosfatos, acetatos, lactatos, alquil (C2-C6) sulfatos, alquil- o alquilarilsulfonatos.

-las sales de amonio cuaternario de imidazolinio,

- las sales de diamonio cuaternario de fórmula (VI) :

(VI)

en la que R9 designa un radical alifático que comprende aproximadamente de 16 a 30 átomos de carbono, R10, R11, R12, R13 y R14, idénticos o diferentes, se seleccionan entre el hidrógeno o un radical alquilo que comprende de 1 a 4 átomos de carbono, y X es un anión seleccionado en el grupo de los halogenuros, acetatos, fosfatos, nitratos y metilsulfatos,

-las sales de amonio cuaternario que contienen al menos una función éster.

11. Utilización según la reivindicación 8, caracterizada por que dicha sal de amonio cuaternario se selecciona entre las sales de amonio cuaternario de fórmula general (IV) siguiente:

(IV)

en la que los radicales R1 a R4, idénticos o diferentes, representan un radical alifático, lineal o ramificado, seleccionado entre los radicales alquilo, alcoxi, alquilamida o hidroxialquilo que comprenden de 1 a 30 átomos de carbono, los radicales polioxialquileno (C2-C6) , alquil (C12-C22) amido alquilo (C2-C6) o alquil (C12-C22) acetato; y X es un anión seleccionado en el grupo de los halogenuros, fosfatos, acetatos, lactatos, alquil (C2-C6) sulfatos, alquil- o alquilarilsulfonatos.

12. Procedimiento de tratamiento cosmético que comprende la aplicación tópica de una composición que comprende al menos un oligonucleótido de ARN bicatenario, caracterizado por que el oligonucleótido bicatenario se adhiere a la superficie de al menos una partícula catiónica de un tamaño inferior o igual a 1 !m, de potencial zeta comprendido entre 10 y 80 mV, comprendiendo dicha partícula al menos un tensioactivo catiónico y siendo seleccionada entre las micelas de tensioactivos y las micelas de polímeros bloques, siendo dicho tensioactivo catiónico seleccionado entre las sales de amonio cuaternario.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado por que la aplicación tópica está precedida de un pretratamiento de la piel seleccionado entre un "strippng", un "peeling" químico, una dermo-abrasión mecánica, la aplicación de uno o varios disolventes que tienen un efecto deslipidante, la limpieza de la piel mediante un producto espumante detergente.

14. Procedimiento según la reivindicación 12 o 13, caracterizado por que la aplicación tópica está seguida de un postratamiento oclusivo.

15. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado por que dicha sal de amonio cuaternario se selecciona entre:

-las sales de amonio cuaternario de fórmula general (IV) siguiente:

(IV)

en la que los radicales R1 a R4, idénticos o diferentes, representan un radical alifático, lineal o ramificado, seleccionado entre los radicales alquilo, alcoxi, alquilamida o hidroxialquilo que comprenden de 1 a 30 átomos de carbono, los radicales polioxialquileno (C2-C6) , alquil (C12-C22) amido alquilo (C2-C6) , o alquil (C12-C22) acetato; y X es un anión seleccionado en el grupo de los halogenuros, fosfatos, acetatos, lactatos,

alquil (C2-C6) sulfatos, alquil- o alquilarilsulfonatos.

-las sales de amonio cuaternario del imidazolinio,

-las sales de diamonio cuaternario de fórmula (VI) :

(VI)

en la que R9 designa un radical alifático que comprende aproximadamente de 16 a 30 átomos de carbono,

R10, R11, R12, R13 y R14, idénticos o diferentes, se seleccionan entre el hidrógeno o un radical alquilo que comprende de 1 a 4 átomos de carbono, y X es un anión seleccionado en el grupo de los halogenuros, acetatos, fosfatos, nitratos y metilsulfatos,

-las sales de amonio cuaternario que contienen al menos una función éster.

16. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado por que dicha sal de amonio cuaternario se selecciona 25 entre las sales de amonio cuaternario de fórmula general (IV) siguiente:

(IV)

en la que los radicales R1 a R4, idénticos o diferentes, representan un radical alifático, lineal o ramificado, seleccionado entre los radicales alquilo, alcoxi, alquilamida o hidroxialquilo que comprenden de 1 a 30 átomos de carbono, los radicales polioxialquileno (C2-C6) , alquil (C12-C22) amido alquilo (C2-C6) , o alquil (C12-C22) acetato; y

X es un anión seleccionado en el grupo de los halogenuros, fosfatos, acetatos, lactatos, alquil (C2-C6) sulfatos, alquil- o alquilarilsulfonatos.

17. Utilización de partículas catiónicas de un tamaño inferior o igual a 1 !m, de potencial zeta comprendido entre 10 y 80 mV, comprendiendo dicha partícula al menos un tensioactivo catiónico y siendo seleccionada entre las micelas de tensioactivos y las micelas de polímeros bloques como agente que favorece la penetración tópica u ocular de al

menos un oligonucleótido de ARN bicatenario, siendo dicho tensioactivo seleccionado entre las sales de amonio cuaternario.

18. Utilización según la reivindicación 17, caracterizada por que dicha sal de amonio cuaternario se selecciona entre:

-las sales de amonio cuaternario de fórmula general (IV) siguiente: (IV)

en la que los radicales R1 a R4, idénticos o diferentes, representan un radical alifático, lineal o ramificado, seleccionado entre los radicales alquilo, alcoxi, alquilamida o hidroxialquilo que comprenden de 1 a 30 átomos de carbono, los radicales polioxialquileno (C2-C6) , alquil (C12-C22) amido alquilo (C2-C6) , o alquil

(C12-C22) acetato; y X es un anión seleccionado en el grupo de los halogenuros, fosfatos, acetatos, lactatos, alquil (C2-C6) sulfatos, alquil- o alquilarilsulfonatos.

-las sales de amonio cuaternario del imidazolinio,

-las sales de diamonio cuaternario de fórmula (VI) :

(VI)

en la que R9 designa un radical alifático que comprende aproximadamente de 16 a 30 átomos de carbono, R10, R11, R12, R13 y R14, idénticos o diferentes, se seleccionan entre el hidrógeno o un radical alquilo que comprende de 1 a 4 átomos de carbono, y X es un anión seleccionado en el grupo de los halogenuros, acetatos, fosfatos, nitratos y metilsulfatos,

-las sales de amonio cuaternario que contienen al menos una función éster.

19. Utilización según la reivindicación 17, caracterizada por que dicha sal de amonio cuaternario se selecciona entre las sales de amonio cuaternario de fórmula general (IV) siguiente:

(IV)

en la que los radicales R1 a R4, idénticos o diferentes, representan un radical alifático, lineal o ramificado, seleccionado entre los radicales alquilo, alcoxi, alquilamida o hidroxialquilo que comprenden de 1 a 30 átomos de carbono, los radicales polioxialquileno (C2-C6) , alquil (C12-C22) amido alquilo (C2-C6) , o alquil (C12-C22) acetato; y X es un anión seleccionado en el grupo de los halogenuros, fosfatos, acetatos, lactatos, alquil (C2-C6) sulfatos, alquil- o alquilarilsulfonatos.