Uso de microvesículas en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de enfermedades y afecciones médicas.

Un método para ayudar en el diagnóstico del cáncer de próstata en un sujeto,

que comprende las etapas de:

(a) aislar una fracción de microvesicula de una muestra de orina de un sujeto humano; y

(b) analizar el ARNm en la fracción de microvesícula para la presencia de un gen específico para un cáncerde próstata, en donde el gen es PCA-3 y/o TMPRSS2-ERG, para indicar así la presencia o ausencia decáncer de próstata en el sujeto.

Uso de microvesiculas en el diagnostico, pronostico y tratamiento de enfermedades y afecciones medicas CAMPO DE LA INVENCION La presente invencion se refiere a los campos del diagnostico medico, el monitoreo del paciente, la evaluacion de la eficacia del tratamiento, entrega de acido nucleico y proteina, y la transfusion de sangre. ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los glioblastomas son tumores cerebrales altamente malignos con un mal pronostico a pesar de una intensa investigacion y los esfuerzos clinicos (Louis y otros, 2007) . La naturaleza invasiva de este tumor hace imposible la reseccion quirurgica completa y el tiempo de supervivencia medio es solo de 15 meses aproximadamente (Stupp y otros, 2005) . Las celulas de glioblastoma asi como tambien muchas otras celulas tumorales tienen una notable capacidad para moldear su medio ambiente estromal en su propio beneficio. Las celulas tumorales alteran directamente las celulas circundantes normales para facilitar el crecimiento de la celula tumoral, invasion, quimioresistencia, inmune-evasion y metastasis (Mazzocca y otros, 2005; Muerkoster y otros, 2004; Singer y otros, 2007) . Las celulas tumorales ademas secuestran la vasculatura normal y estimulan la rapida formacion de nuevos vasos sanguineos para suministrar nutrientes al tumor (Carmeliet y Jain, 2000) . Aunque el sistema inmune puede suprimir inicialmente el crecimiento del tumor, frecuentemente se embota progresivamente por la activacion del tumor de las rutas inmunosupresivas (Gabrilovich, 2007) . Las pequenas microvesiculas desprendidas por las celulas se conocen como exosomas (Ther y y otros, 2002) . Los exosomas se reportan como que tienen un diametro de aproximadamente 30-100 nm y se desprenden de muchos tipos de celulas diferentes tanto bajo condiciones normales y patologicas (Ther y y otros, 2002) . Estas microvesiculas se describieron por primera vez como un mecanismo para retirar receptores de transferrina de la superficie celular de los reticulocitos maduros (Pan y Johnstone, 1983) . Los exosomas se forman a traves de la gemacion interna de las membranas endosomales que dan lugar a cuerpos multivesiculares intracelulares (MVB) que luego se fusionan con la membrana plasmatica, liberando los exosomas al exterior (Ther y y otros, 2002) . Sin embargo, ahora hay pruebas para una liberacion mas directa de los exosomas. Ciertas celulas, tales como las celulas T Jurkat, se dice que desprenden directamente exosomas por gemacion hacia el exterior de la membrana plasmatica (Booth y otros, 2006) . Todas las vesiculas de membrana desprendidas por las celulas se refieren colectivamente en la presente invencion como microvesiculas. Las microvesiculas en Drosophila melanogaster, llamadas argosomas, se dice que contienen morfogenos tales como la proteina Wingless y que se mueven a grandes distancias a traves del epitelio del disco imaginal en embriones deDrosophila melanogaster en desarrollo (Greco y otros, 2001) . Las microvesiculas encontradas en el semen, conocidas como prostasomas, se expone que tienen una amplia variedad de funciones que incluye la promocion de la movilidad de los espermatozoides, la estabilizacion de la reaccion del acrosoma, la facilitacion de la inmunosupresion y la inhibicion de la angiogenesis (Delves y otros, 2007) . Por otro lado, los prostasomas liberados por las celulas de prostata malignas se dice que promueven la angiogenesis. Las microvesiculas se dice que transfieren proteinas (Mack y otros, 2000) y estudios recientes exponen que esas microvesiculas aisladas a partir de lineas celulares diferentes ademas pueden contener ARN mensajero (ARNm) y microARN (miARN) y pueden transferir ARN a otros tipos de celulas (Baj-Krzyworzeka y otros, 2006; Valadi y otros, 2007) Las microvesiculas derivadas de las celulas B y las celulas dendriticas se expone que tienen efectos inmuno estimuladores y antitumorales potentes in vivo y se usan como vacunas antitumorales (Chaput y otros, 2005) . Las microvesiculas derivadas de las celulas dendriticas se exponen que contienen las proteinas coestimuladoras necesarias para la activacion de las celulas T, mientras que la mayoria de las microvesiculas derivadas de celulas tumorales no (Wieckowski y Whiteside, 2006) . Las microvesiculas aisladas a partir de celulas tumorales pueden actuar para suprimir la respuesta inmune y acelerar el crecimiento tumoral (Clayton y otros, 2007; Liu y otros, 2006a) . Las microvesiculas de cancer de mama pueden estimular la angiogenesis, y las microvesiculas derivadas de plaquetas pueden promover la progresion tumoral y la metastasis de celulas de cancer de pulmon (Janowska-Wieczorek y otros, 2005; Millimaggi y otros, 2007) . Los canceres surgen a traves de la acumulacion de alteraciones geneticas que promueven el crecimiento celular ilimitado. Se ha expuesto que cada uno de esos tumores albergan, en promedio, alrededor de 50 a 80 mutaciones que estan ausentes en las celulas no tumorales (Jones y otros, 2008; Parsons y otros, 2008; Wood y otros, 2007) . Las tecnicas actuales para detectar estos perfiles de mutacion incluyen el analisis de muestras de biopsia y el analisis no invasivo de fragmentos de ADN de tumores mutantes que circulan en fluidos corporales tales como la sangre (Diehl y otros, 2008) . El primer metodo es invasivo, complicado y posiblemente nocivo para los sujetos. El ultimo metodo carece intrinsecamente de sensibilidad debido al numero muy bajo de copias de ADN de cancer mutante en el fluido corporal (Gormally y otros, 2007) .

Por lo tanto, un desafio orientado al diagnostico del cancer es desarrollar un metodo de diagnostico que pueda detectar celulas tumorales en las diferentes etapas de forma no invasiva, sin embargo con alta sensibilidad y especificidad. Ademas se ha expuesto que esos perfiles de expresion genica (que codifican ARNm o microARN) pueden distinguir el tejido canceroso y no canceroso (Jones y otros, 2008; Parsons y otros, 2008; Schetter y otros, 2008) . Sin embargo, las tecnicas actuales de diagnostico para la deteccion de perfiles de expresion genica requieren biopsia invasiva de tejidos. Algunos procedimientos de biopsia causan alto riesgo y son potencialmente nocivos. Por otra parte, en un procedimiento de biopsia, las muestras de tejido se toman a partir de un area limitada y pueden dar falsos positivos o falsos negativos, especialmente en tumores que son heterogeneos y/o dispersados dentro del tejido normal. Por lo tanto, un metodo de diagnostico no invasivo y sensible para la deteccion de biomarcadores seria altamente deseable.

RESUMEN DE LA INVENCION

Generalmente, esta descripcion se refiere a un nuevo metodo para detectar en un sujeto la presencia o ausencia de una diversidad de biomarcadores contenidos en las microvesiculas, ayudando de ese modo al diagnostico, seguimiento y evaluacion de enfermedades, otras afecciones medicas y la eficacia del tratamiento asociado con biomarcadores de microvesiculas.

La invencion es un metodo para ayudar en el diagnostico del cancer de prostata en un sujeto, que comprende las etapas de: a) aislar una fraccion de microvesicula a partir de una muestra de orina de un sujeto humano; y b) analizar el ARNm en la fraccion de microvesicula para la presencia de un gen especifico para un cancer de prostata, en donde el gen es PCA-3 y/o TMPRSS2-ERG, para indicar asi la presencia o ausencia de cancer de prostata en el sujeto.

Se describe un metodo para ayudar en la evaluacion de la eficacia del tratamiento en un sujeto, que comprende las etapas de: a) aislar una fraccion de microvesicula a partir de una muestra biologica del sujeto; y b) detectar la presencia o ausencia de un biomarcador dentro de la fraccion de microvesicula, en donde el biomarcador se asocia con la eficacia del tratamiento para una enfermedad u otra afeccion medica. El metodo puede comprender ademas la etapa de proporcionar una serie de muestras biologicas durante un periodo de tiempo del sujeto. Ademas, el metodo puede comprender ademas la etapa o etapas de determinar cualquier cambio medible en los resultados de la etapa de deteccion (por ejemplo, la cantidad de uno o mas biomarcadores detectados) en cada una de las muestras biologicas a partir de la serie para asi evaluar la eficacia del tratamiento para la enfermedad u otra afeccion medica.

Se describe ademas un metodo para ayudar en el diagnostico o monitoreo de una enfermedad u otra afeccion medica en un sujeto, que comprende las etapas de a) obtener una muestra biologica del sujeto; y b) determinar la concentracion de microvesiculas dentro de la muestra biologica.

Ademas se describe un metodo para entregar un acido nucleico o una proteina a una celula diana en un individuo que comprende las etapas de administracion de las microvesiculas que contienen el acido nucleico o la proteina, o una o mas celulas que producen tales microvesiculas, al individuo de manera que las microvesiculas entran... [Seguir leyendo]

1. Un metodo para ayudar en el diagnostico del cancer de prostata en un sujeto, que comprende las etapas de:

(a) aislar una fraccion de microvesicula de una muestra de orina de un sujeto humano; y

(b) analizar el ARNm en la fraccion de microvesicula para la presencia de un gen especifico para un cancer de prostata, en donde el gen es PCA-3 y/o TMPRSS2-ERG, para indicar asi la presencia o ausencia de cancer de prostata en el sujeto.

º. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la etapa (a) se realiza por cromatografia de exclusion por tamano, centrifugacion con gradiente de densidad, centrifugacion diferencial, ultrafiltracion en nanomembrana, captura inmunoabsorbente, purificacion por afinidad, separacion microfluidica, o combinaciones de los mismos.

º. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde la etapa (b) se realiza por analisis de microarreglo, PCR, hibridacion con sondas especificas de alelo, deteccion de mutaciones enzimaticas, reaccion en cadena de ligacion (LCR) , ensayo de ligacion de oligonucleotidos (OLA) , analisis de heteroduplos por citometria de flujo, clivaje quimico mal apareado, espectrometria de masa, secuenciacion de acido nucleico, polimorfismo de conformacion monocatenaria (SSCP) , electroforesis de gel en gradiente desnaturalizante (DGGE) , electroforesis de gel en gradiente de temperatura (TGGE) , polimorfismos de fragmentos de restriccion, analisis en serie de la expresion genica (SAGE) , o combinaciones de los mismos.

º. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, en donde la etapa de aislamiento incluye el filtrado.

5. El metodo de la reivindicacion 4, en donde el filtrado es a traves de un filtro de a 0.8 micras.

6. El metodo de la reivindicacion 4 o reivindicacion 5, en donde el filtrado es seguido por concentracion por ultrafiltracion.

7. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde el filtrado es seguido por ultracentrifugacion.