Sistema de cultivo de células, un procedimiento para su producción así como su utilización en la investigación preclínica.

Sistema de cultivo de células, en particular para el ensayo preclínico de sustancias activas,

que comprende unoscompartimentos primero y segundo, los cuales están comunicados entre sí a través de una capa de separación quees permeable para sustancias secretadas celularmente, que está situada entre los compartimentos primero ysegundo, conteniendo el primer compartimento un cultivo sintópico con células tisulares y células inmunitariasfagocitadoras, y el segundo compartimento un cultivo con células sanguíneas.

Sistema de cultivo de células, un procedimiento para su producción así como su utilización en la investigación preclínica El invento se refiere a un sistema de cultivo de células así como a la utilización del sistema de cultivo de células para el ensayo preclínico de sustancias activas.

El escrutinio preclínico de sustancias activas o respectivamente el ensayo preclínico de sustancias activas presenta una importancia especial para la validación médica de ciertas sustancias, antes de que éstas sean ensayadas en estudios clínicos con seres humanos después de haber superado con éxito esta fase de ensayo preclínico. Otro punto esencial del ensayo preclínico lo constituye, junto a la comprobación de un efecto médico principal de las sustancias que deben de ser ensayadas, también la estimación de unos posibles efectos secundarios, que podrían resultar en el caso de otra validación de sustancias activas en estudios clínicos.

Así, por ejemplo, el reconocimiento precoz de unos indeseados efectos secundarios hace posible conseguir ahorros de costos. Además de ello, el riesgo para los pacientes de ensayos clínicos se puede reducir manifiestamente mediante una investigación preclínica madurada de sustancias activas.

Como modelos preclínicos de investigación entran en consideración en particular los animales de ensayo. Los ensayos con animales tienen la ventaja de que las sustancias activas que deben de ser investigadas, pueden ser caracterizadas in vivo. No obstante, los reconocimientos obtenidos a partir de éstos son transferibles, solamente en una extensión restringida, también a los seres humanos, debido a las diferencias parcialmente agravantes entre los animales y los seres humanos.

En la fase preclínica de ensayo de sustancias activas pasan a emplearse además unos cultivos de células como modelos de investigación. El empleo de cultivos de células ofrece la ventaja de que éstos se pueden llevar a cabo de un modo relativamente sencillo. Además de esto, los cultivos de células permiten unas altos caudales de paso de las muestras y unas condiciones de ensayo muy bien controlables. Además, con respecto a los cultivos de células no existe ningún reparo ético. Es desventajoso el hecho de los cultivos de células, como modelos de investigación in vitro, pueden simular sólo insuficientemente los procesos celulares que tienen lugar realmente en tejidos humanos.

Un perfeccionamiento interesante de los cultivos de células lo constituyen los denominados cultivos concomitantes. Tales cultivos concomitantes se componen de dos cultivos de células separados en el espacio uno de otro, entre los cuales es posible, sin embargo, un intercambio de sustancias. Uno de los cultivos de células contiene regularmente unas células de determinados tipos de tejidos, mientras que el otro cultivo de células contiene determinadas células sanguíneas, en particular unas células mononucleares de sangre periférica (en inglés "peripheral blood mononuclear cells, PMBC) . Para el ensayo preclínico de sustancias activas, los cultivos de células se incuban en presencia de las sustancias activas que deben de ser ensayadas. Los flujos de sustancias que tienen lugar en el cultivo concomitante son investigados y evaluados después de la fase de incubación. Tales cultivos concomitantes son conocidos, por ejemplo, a partir de los artículos "IL-10 producing CD14low monocytes inhibit lymphocyte-dependent activation of intestinal epithelial cells by commensal bacteria” [Unos monocitos CD14low productores de IL-10 inhiben la activación dependiente de linfocitos de las células epiteliales intestinales por bacterias comensales] (Haller D, Microbiol. Immunol. 2002; 46: 195-205) y "Monocyte/Macrophage Regulation of Vascular Calcification In Vitro” [Regulación por monocitos y macrófagos de la calcificación vascular in vitro] (Tintut Y, Circulation 2002, 105: 650-655) . En este caso es desventajoso el hecho que, al fin y al cabo, también los cultivos concomitantes pueden reproducir sólo insuficientemente las circunstancias reales en seres humanos o animales, en particular en el sector de los procesos inmunorreguladores. Los reconocimientos obtenidos con ayuda de tales cultivos concomitantes se deben de considerar por lo tanto siempre con un cierto escepticismo en lo que respecta a una valoración o respectivamente a una caracterización fiable de las sustancias activas ensayadas. Por otra parte, los requisitos planteados en cuanto a la calidad de un escrutinio preclínico de sustancias activas son constantemente más exigentes a causa de los posibles riesgos clínicos así como de los costos de desarrollo de los medicamentos, que por lo general se están haciendo cada vez más altos.

El invento se plantea, por consiguiente, la misión de poner a disposición un modelo de investigación in vitro para el ensayo preclínico de sustancias activas, que, en comparación con los modelos de investigación conocidos a partir del estado de la técnica, haga posible una reproducción mejorada de las complejas circunstancias fisiológicas en un organismo humano y/o animal, y en particular una caracterización más fiable de las sustancias activas en lo que respecta a su investigación clínica.

El problema planteado por esta misión se resuelve mediante un sistema de cultivo de células, en particular para el ensayo preclínico de sustancias activas, que comprende unos compartimentos primero y segundo, que están en comunicación entre sí a través de una capa de separación que es permeable para sustancias secretadas (excretadas) celularmente, que está situada entre dichos compartimentos primero y segundo, conteniendo el primer compartimento un cultivo sintópico con células tisulares y células inmunitarias fagocitadoras, y el segundo compartimento un cultivo con células sanguíneas (cultivo de células sanguíneas) .

Por el concepto de "un cultivo sintópico" dentro del sentido del presente invento se debe de entender un cultivo de células, que tiene en un compartimento por lo menos un tipo de células tisulares y por lo menos un tipo de células del sistema inmunitario.

Por el concepto de "sangre entera" dentro del sentido del presente invento se deben de entender todos los componentes de la sangre, inclusive las células sanguíneas y el plasma sanguíneo así como los factores de manera preferida biológicamente activos, que están contenidos en éste, tales como los factores de la coagulación, las proteínas del complemento, etc.

Por el concepto de "cebadura" dentro del sentido del presente invento se debe de entender una activación previa (preactivación) de células, que es provocada por ciertas sustancias, en particular por unas sustancias mensajeras.

Mediante el invento se ponen a disposición unos sistemas de cultivo de células que, a causa de la toma en consideración de un cultivo sintópico con células tisulares y células inmunitarias fagocitadoras, así como de un cultivo con células sanguíneas, se diferencian manifiestamente en cuanto a su complejidad celular con respecto de los sistemas de cultivo concomitante conocidos hasta ahora. El sistema de cultivo de células conforme al invento puede ser considerado en particular como un cultivo concomitante sintópico. En comparación con los conocidos sistemas de cultivo concomitante, el sistema de cultivo de células conforme al invento hace posible una comunicación esencialmente más compleja y en particular más diferenciada entre las células. Los flujos de sustancias y los mecanismos de regulación que tienen lugar entre las células del sistema de cultivo de células permiten realizar una simulación manifiestamente mejorada de los procesos celulares que tienen lugar realmente en un organismo humano y/o animal. Las sustancias secretadas celularmente pueden reaccionar en particular con unas correspondientes células diana en el sistema de cultivo de células y, por ejemplo, pueden ser consumidas de nuevo. Por consiguiente, con una ventaja especial se pueden evitar unas concentraciones excesivas no naturales en el sistema de cultivo de células conforme al invento. Además, las células dianas modifican su producción propia de sustancias de señal bajo la influencia de las sustancias mensajeras secretadas por las otras células. De esta manera se modifica de un modo muy fisiológico la red reguladora global del sistema de cultivo de células conforme al invento. El sistema de cultivo de células conforme al invento se adecua en medida especial para la validación preclínica de sustancias activas. Para esto, se utilizan convenientemente las células de una especie, que debe de ser tratada en una fase clínica posterior con las sustancias activas que deben de ser ensayadas. El sistema de cultivo de células se incuba en común con las sustancias... [Seguir leyendo]

1. Sistema de cultivo de células, en particular para el ensayo preclínico de sustancias activas, que comprende unos compartimentos primero y segundo, los cuales están comunicados entre sí a través de una capa de separación que es permeable para sustancias secretadas celularmente, que está situada entre los compartimentos primero y segundo, conteniendo el primer compartimento un cultivo sintópico con células tisulares y células inmunitarias fagocitadoras, y el segundo compartimento un cultivo con células sanguíneas.

2. Sistema de cultivo de células de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que en el caso de las células 10 inmunitarias se trata de monocitos y/o macrófagos.

3. Sistema de cultivo de células de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que en el caso de las células tisulares se trata de unas células, que se presentan en unos tejidos con una enfermedad inflamatoria.

4. Sistema de cultivo de células de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que en el caso de las células tisulares se trata de unas células, que se escogen entre:

-células epiteliales y/o células similares a las epiteliales,

-células bronquiales y/o células epiteliales intestinales,

-células endoteliales, de manera preferida unas células endoteliales de vasos sanguíneos,

-células cutáneas, en particular células cutáneas de las articulaciones (sinoviocitos) , y/o condrocitos. 25

5. Sistema de cultivo de células de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que las células del sistema de cultivo de células proceden de uno/a de los/las siguientes:

-linajes de células, de manera preferida de origen humano, 30

-muestras de tejidos y/o muestras de líquidos corporales.

6. Sistema de cultivo de células de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que en el

caso del cultivo del segundo compartimento se trata de un cultivo de la sangre entera (cultivo de sangre entera) , en 35 particular de sangre fresca, de manera preferida de origen humano.

7. Sistema de cultivo de células de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que las células tisulares son activadas, en particular modificadas inflamatoriamente.

8. Sistema de cultivo de células de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que en el caso de las sustancias secretadas celularmente se trata de unos indicadores de una actividad celular, en particular de unas sustancias mensajeras, de manera preferida de unas citocinas.

9. Sistema de cultivo de células de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que en el 45 caso de las sustancias activas, que deben de ser ensayadas, se trata de sustancias activas biológicas y/o sintéticas.

10. Sistema de cultivo de células de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la capa de separación tiene unas aberturas, en particular unos poros, con un diámetro comprendido entre 0, 1 y 5 μm, en particular comprendido entre 0, 2 y 0, 45 μm.

11. Sistema de cultivo de células de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que los compartimentos del sistema de cultivo de células están estructurados en forma de unos recipientes, en particular como unas escudillas, unas cámaras, unas cavidades o unos pocillos (en inglés "wells") .

12. Procedimiento para el ensayo preclínico de sustancias activas mediando utilización de un sistema de cultivo de células de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes 1 hasta 11, que comprende las etapas de:

-una adición de sustancias activas al sistema de cultivo de células,

-una incubación del sistema de cultivo de células en presencia de las sustancias activas añadidas,

-una investigación de los indicadores de una actividad celular, que son detectables en el sistema de cultivo de células.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado por que el sistema de cultivo de células, en particular el cultivo sintópico, es sometido a una cebadura antes de la incubación, de manera preferida antes de la adición de las sustancias activas.

14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado por que para la cebadura del sistema de cultivo de células se utilizan unos mediadores o activadores, en particular unos activadores inflamatorios.

15. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 hasta 14, caracterizado por que la investigación de los indicadores de una actividad celular se lleva a cabo mediante unos métodos de biología molecular, en particular 10 en el plano de la transcripción y/o traducción, de manera preferida en el plano posterior a la traducción.

16. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 hasta 15, caracterizado por que para la investigación de los indicadores de una actividad celular de las células se investigan unas sustancias secretadas por las células del sistema de cultivo de células y/o las células del sistema de cultivo de células.

17. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado por que en el caso de la investigación de las células del sistema de cultivo de células, las células son recuperadas para la realización de la investigación.

18. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 hasta 17, caracterizado por que para la

investigación de los indicadores de una actividad celular, se investigan unos parámetros de activación situados en la célula, en particular la expresión de transductores de señales y/o receptores en y/o sobre las células del sistema de cultivo de células.

19. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 hasta 18, caracterizado por que los indicadores de una actividad celular son investigados en relación con los indicadores de una actividad celular de un sistema de cultivo de células exento de sustancias activas.

20. Utilización de un sistema de cultivo de células de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 11 para el

ensayo preclínico de sustancias activas, en particular para la investigación de las relaciones entre dosis y efectos de 30 las sustancias activas.

Figura 2: Investigaciones comparativas con sinoviocitos y macrófagos en unos cultivos sintópicos. Se escogieron tres diferentes condiciones de estimulación: ninguna estimulación ("0") , un ligando de TLR ("LPS") y un ligando específico para integrinas ("Zym") . El cultivo se llevó a cabo o bien solamente con sinoviocitos ("Syn") , con macrófagos ("MPh") o sino con ambos ("Syn + MPh") . Según sean la condición de estimulación y el punto final, la combinación de las células muestra diferentes efectos sobre la síntesis de ciertos mediadores.

Figura 3: Investigación de diclofenac en diferentes variantes de cultivos concomitantes, que se componen de sangre entera en el compartimento inferior del cultivo, y o bien de sinoviocitos ("Syn") o macrófagos ("MPh") o, como una variante sintópica, de sinoviocitos + macrófagos ("Syn + MPh") en el compartimento superior. Los puntos finales fueron las síntesis de MCP-1 e IL-6 como respuesta a una activación por LPS, que abarca al compartimento tanto superior como también inferior de este cultivo concomitante.