Procedimiento de producción de celulasas basado en la regulación de la oscilación de la presión de oxígeno disuelto en el medio de cultivo.

Procedimiento de producción de enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas mediante un microorganismocelulolítico en un biorreactor ventilado y agitado que comprende una fase de crecimiento en presencia de una fuentede carbono y una fase de producción en presencia de un sustrato inductor carbonado en el cual el aporte de sustratoinductor carbonado durante la fase de producción se regula en función de la presión parcial de oxígeno disuelto en elmedio de crecimiento,

oscilando dicha presión entre dos valores PO2min y PO2max, siendo el valor de PO2min superior ala presión crítica PO2critica por debajo de la cual el metabolismo del microorganismo se ve afectado e inferior al 95 %de la presión parcial de oxígeno con saturación PO2sat fijada cuando se arranca el biorreactor, y siendo el valor dePO2max superior al menos en un 5 % a PO2min, realizándose la adición de sustrato inductor carbonado en cuanto lapresión parcial de oxígeno disuelto en el medio es superior al valor de PO2max y se detiene en cuanto la presión deoxígeno disuelto en el medio es inferior al valor PO2min.

Procedimiento de producción de celulasas basado en la regulación de la oscilación de la presión de oxígeno disuelto en el medio de cultivo 5

Campo de la invención La invención se refiere a un procedimiento de producción de enzimas para la hidrólisis de biomasa lignocelulósica.

Antecedentes de la invención La biomasa lignocelulósica se caracteriza por una estructura compleja constituida por tres polímeros principales: la celulosa, la hemicelulosa y la lignina. La celulosa y eventualmente las hemicelulosas son los blancos de la hidrólisis enzimática pero no son directamente accesibles para las enzimas.

Es la razón por la cual estos sustratos deben experimentar un pretratamiento anterior a la etapa de hidrólisis enzimática. El pretratamiento pretende modificar las propiedades físicas y fisicoquímicas del material lignocelulósico, con el fin de mejorar la accesibilidad de la celulosa atrapada en la matriz de lignina y de hemicelulosa. Estos pretratamientos pueden ser de diferentes tipos: se pueden citar las cocciones ácidas, las cocciones alcalinas, la explosión de vapor, o incluso los procesos Organosolv.

La etapa de hidrólisis enzimática permite la transformación de la celulosa y de las hemicelulosas en azúcares mediante el uso de enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas. Algunos microorganismos, como los hongos que pertenecen a los géneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium o Schizophyllum, o las bacterias anaerobias que pertenecen, por ejemplo, al género Clostridium, producen estas enzimas, que contienen en particular las celulasas y las hemicelulasas, adaptadas a la hidrólisis total de la celulosa y de las hemicelulosas.

Los azúcares que se obtienen mediante la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica son pentosas (xilosa y arabinosa principalmente) , disacáridos (celobiosa) y glucosa que se pueden fermentar mediante los microorganismos. La glucosa se puede, por ejemplo, transformar fácilmente en etanol mediante la levadura Saccharomyces cerevisiae en la etapa de fermentación alcohólica.

Por último, una etapa de destilación permite separar y recuperar el producto resultante de la fermentación obtenido de este modo, por lo tanto el etanol en el caso anterior, del mosto de fermentación.

Los diferentes estudios técnicos y económicos demuestran la necesidad de reducir los costes ligados a la etapa de hidrólisis enzimática para llevar el coste del etanol producido a unos valores próximos al etanol obtenido a partir de almidón.

Uno de los medios de reducción de los costes consiste en optimizar las condiciones operativas del procedimiento de producción de celulasas de tal modo que se aumente la productividad o que se obtenga un cóctel enzimático con una actividad específica mejorada.

El microorganismo más utilizado para la producción de celulasas es el hongo filamentoso Trichoderma reesei. Las 45 cepas salvajes tienen la facultad de secretar, en presencia de un sustrato inductor como, por ejemplo, la celulosa o la lactosa, un complejo enzimático bien adaptado a la hidrólisis de la celulosa. Las enzimas del complejo enzimático contienen tres grandes tipos de actividad: las endoglucanasas, las exoglucanasas y las celobiasas.

Los mecanismos complejos de regulación de la síntesis de las celulasas precisan unas implementaciones 50 específicas para su producción en un reactor. El empleo de cepas no sensibles a la represión catabólica y de sustratos inductores solubles y utilizables a gran escala, como la lactosa, ha permitido obtener grandes producciones del orden de 40 g/l de proteínas extracelulares mediante T. reesei CL 847 de acuerdo con un procedimiento descrito en Bioresource Technol. (1992) 39, pág. 125-130. En este procedimiento, la fermentación se desarrolla en dos fases, una primera fase en lotes de producción de células de T. reesei, y una segunda fase de alimentación en modo de 55 alimentación por lotes del inductor a una velocidad que evita su acumulación en el medio.

Al no mantenerse siempre el estado fisiológico del microorganismo en su estado óptimo para la producción de enzimas, se observan en determinados casos fenómenos de crecimiento de células no productivas, de lisis celular o de esporulación no deseada, que implican la disminución de la productividad de enzimas. El equilibrio entre los 60 estados de producción óptima y los estados fisiológicos indeseables es bastante sensible. Bailey y otros (Appl. Microbiol. Biotechnol, 2003, 62: págs. 156-162) ha demostrado que la productividad de las celulasas era óptima cuando las células estaban en un estado cercano al límite de sustrato carbonado en el medio. Este propuso un procedimiento de adición de sustrato carbonado que aplica el seguimiento de la tasa de consumo de base utilizada para el control del pH.

Por otra parte, el procedimiento que se describe en la patente EP-B1-0448430 precisa un aporte optimizado del flujo de azúcar de entre 35 y 45 mg.g-1.h-1. En efecto, un flujo demasiado alto lleva a una acumulación de sustrato carbonado en el medio, lo que conduce a un cambio metabólico hacia la producción de biomasa en lugar de la producción de enzimas. Un flujo demasiado bajo conduce, por su parte, a una lisis de la biomasa y a una pérdida de producción. Además, el Trichoderma reesei excreta entonces más proteasas que vuelven a consumir una parte de las celulasas producidas.

La presente invención propone un procedimiento que permite mantener el microorganismo en el estado correspondiente a su estado óptimo para la producción de enzimas.

Resumen de la invención La invención propone un procedimiento de producción de enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas en el cual el aporte de sustrato inductor carbonado necesario para la fase de producción se regula mediante una oscilación de la presión de oxígeno disuelto en el medio.

Descripción de los dibujos La figura 1 representa el registro de la presión de oxígeno disuelto en el medio en función del tiempo así como el caudal de aporte de sustrato carbonado.

Descripción detallada de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas mediante un microorganismo celulolítico en un biorreactor agitado y ventilado que comprende una fase de crecimiento en presencia de una fuente de carbono y una fase de producción en presencia de un sustrato inductor carbonado en el cual el aporte de sustrato inductor carbonado durante la fase de producción se regula en función de la presión parcial de oxígeno disuelto en el medio de crecimiento, oscilando dicha presión entre dos valores PO2min y PO2max, siendo el valor de PO2min superior a la presión crítica PO2critica por debajo de la cual la actividad del microorganismo se ve afectada e inferior al 95 % de la presión parcial de oxígeno con saturación PO2sat fijada en el arranque del biorreactor, y siendo el valor de PO2max superior al menos en un 5 % a PO2min, realizándose la adición de sustrato inductor carbonado en cuanto la presión parcial de oxígeno disuelto en el medio es superior al valor de PO2max y se detiene en cuanto la presión de oxígeno disuelto en el medio es inferior al valor PO2min.

Este procedimiento permite optimizar la producción de enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas manteniendo las células en una fase de productividad óptima.

Por medio del procedimiento de acuerdo con la invención, se puede producir un cóctel enzimático que presenta una actividad específica hasta un 50 % más elevada que la de las enzimas obtenidas con un procedimiento clásico de producción en el que el límite de carbono se impone con un caudal constante.

Además, este procedimiento presenta la ventaja de ser robusto y fácil de implementar. También permite evitar la acumulación de azúcares en el medio, lo que conduce a la formación de biomasa en detrimento de la producción de enzimas.

Las cepas de microorganismos utilizadas se cultivan en biorreactores agitados y ventilados en unas condiciones compatibles con su crecimiento y la producción de enzimas.

Al inicio de la fermentación, el biorreactor está saturado en oxígeno y la presión parcial de oxígeno disuelto en el medio que corresponde a la saturación se designa PO2sat.

La fuente de carbono utilizada para la fase de crecimiento se introduce en el biorreactor de tal modo que tenga una concentración inicial en azúcar para el comienzo de la fase de producción comprendida entre 15 y 60 g/l.

Durante la fase de crecimiento, la ventilación se fija en un valor que selecciona el operario y la presión parcial de oxígeno PO2 se regula en un porcentaje, definido por el operario, de la presión en saturación... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de producción de enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas mediante un microorganismo celulolítico en un biorreactor ventilado y agitado que comprende una fase de crecimiento en presencia de una fuente 5 de carbono y una fase de producción en presencia de un sustrato inductor carbonado en el cual el aporte de sustrato inductor carbonado durante la fase de producción se regula en función de la presión parcial de oxígeno disuelto en el medio de crecimiento, oscilando dicha presión entre dos valores PO2min y PO2max, siendo el valor de PO2min superior a la presión crítica PO2critica por debajo de la cual el metabolismo del microorganismo se ve afectado e inferior al 95 % de la presión parcial de oxígeno con saturación PO2sat fijada cuando se arranca el biorreactor, y siendo el valor de PO2max superior al menos en un 5 % a PO2min, realizándose la adición de sustrato inductor carbonado en cuanto la presión parcial de oxígeno disuelto en el medio es superior al valor de PO2max y se detiene en cuanto la presión de oxígeno disuelto en el medio es inferior al valor PO2min.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el cual PO2max está comprendida entre un 30 y un 70 % de 15 PO2sat yPO2min está comprendida entre un 10 y un 60 % de PO2sat.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2 en el cual PO2max está comprendida entre un 40 y un 60 % de PO2sat yPO2min está comprendida entre un 30 y un 50 % de PO2sat.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores en el cual el sustrato inductor carbonado se selecciona entre la lactosa, la xilosa, la celobiosa, la soforosa, los residuos obtenidos tras la fermentación etanólica de los azúcares monómeros de los hidrolizados enzimáticos de biomasa celulósica, y/o un extracto bruto de pentosas hidrosolubles procedentes del pretratamiento de una biomasa celulósica.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores en el cual el aporte de sustrato se realiza en solución.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 en el cual el sustrato inductor carbonado seleccionado para la fase de producción de las enzimas se encuentra en una concentración de entre 10 y 800 g/l, de preferencia en una 30 concentración entre 150 y 600 g/l.

7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 o 6 en el cual el sustrato inductor carbonado es una solución de lactosa, de preferencia en una concentración de 250 g/l.

8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores en el cual la agitación y la ventilación del biorreactor se fijan en un valor predefinido que permite tener una capacidad de oxigenación de dicho biorreactor comprendida entre 50 y 150 h-1.

9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores en el cual el microorganismo celulolítico se 40 seleccionado entre los hongos que pertenecen a los géneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium y Schizophyllum.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9 en el cual el microorganismo celulolítico pertenece a la especie Trichoderma reesei.