Placa para gotas en suspensión.

Placa para gotas en suspensión (1), que comprende un cuerpo (2) con una primera superficie (3) y una segundasuperficie (4) que es esencialmente coplanaria a la primera superficie (3) y que comprende al menos un área decontacto de gota (5) para recibir de manera adherente un volumen líquido (6) para cultivar células o para produciragregados moleculares en su interior,

diferenciándose la por lo menos un área de contacto de gota (5) de un áreacircundante (7) por una estructura en relieve (8) o un revestimiento hidrófobo selectivo (21) que impide la dispersióndel volumen líquido (6) sobre la segunda superficie (4) del cuerpo (2), caracterizada porque el cuerpo (2)comprende adicionalmente al menos un conducto (9) que desemboca en la por lo menos un área de contacto degota (5) desde la dirección de la primera superficie (3) del cuerpo (2), comprendiendo el conducto (9) uncompartimento de cultivo (13) que está situado cerca de la segunda superficie (3) del cuerpo (2) y que comprende almenos una parte del área de contacto de gota (5).

Placa para gotas en suspensión De acuerdo con la parte genérica de la reivindicación 1 independiente, la presente invención se refiere a una placa para gotas en suspensión. Esta placa para gotas en suspensión comprende un cuerpo con una primera superficie y una segunda superficie que es esencialmente coplanaria a la primera superficie. La segunda superficie comprende al menos un área de contacto de gota para recibir de manera adherente un volumen líquido. En este volumen líquido, pueden cultivarse células o pueden producirse agregados moleculares. Este área de contacto de gota se diferencia de un área circundante por una estructura en relieve o un revestimiento hidrófobo selectivo que impide la dispersión del volumen líquido sobre la segunda superficie del cuerpo de la placa para gotas en suspensión.

Generalmente se acepta que las células cultivadas en una configuración 3D son fisiológicamente más relevantes que las células cultivadas en cultivos monocapa clásicos (véase, por ejemplo, Yamada y Cukiermann, Cell, 2007; Pamploni y col. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2007) . La coaxión de células en tres dimensiones supone la quinta esencia de los problemas de diseño. Las tecnologías actuales se basan principalmente en el uso de materiales de soporte o apilamiento de monocapas para dar forma a las células. Sin embargo, a pesar del beneficio biológico, las tecnologías actuales del estado de la técnica no son rutinarias de laboratorio o se usan a una escala industrial para aplicaciones tales como descubrimiento de fármacos o ensayos de toxicidad dado que el proceso de cultivo celular es más complejo, lleva tiempo y requiere biomateriales adicionales. La re-agregación de células es una estrategia alternativa para empujar a las células hasta la tercera dimensión Sin embargo las tecnologías actuales de re-agregación se han constatado principalmente con líneas celulares neoplásicas y carecen de posibilidades de cocultivo controladas. Se ha demostrado que la tecnología de gotas en suspensión (HD, Hanging Drop) es un procedimiento universal que permite cultivar células en 3D con células neoplásicas así como primarias (véase Kelm y Fussenegger, 2004, Trends in Biotechnology Vol. 22, No. 4: 195-202) . Las gotas del medio de cultivo celular con células en suspensión se colocan sobre una superficie de cultivo celular y la placa se invierte. Al no disponer de un sustrato sobre el que las células puedan adherirse, estas se acumulan en la parte inferior de la gota y forman un microtejido.

El cultivo de células en gotas que están suspendidas en una superficie es bien conocido por el experto en la técnica. A partir del documento DE 103 62 002 B4, se conoce, por ejemplo, la manera normal de depositar gotas de una suspensión celular en un medio nutriente con una pipeta sobre la superficie interna de una tapa de una placa de Petri. Después la tapa de la placa de Petri debe invertirse y colocarse sobre una placa base de placa de Petri apropiada. En la placa de Petri cerrada de esta manera, las gotas están suspendidas desde la superficie de la cubierta. Con frecuencia la placa de Petri contiene papel de filtro húmedo para proporcionar a las gotas en suspensión una atmósfera húmeda que impide que las gotas en suspensión se sequen. Una de las etapas más críticas de esta técnica de gotas en suspensión convencional es invertir la placa en la que las gotas están adheridas; por tanto, esta etapa crucial con frecuencia debe realizarla manualmente un investigador con experiencia.

A partir del documento WO 03/078700 A1, la aplicación de la técnica de gotas en suspensión se conoce para el cultivo de células madre y para la producción de cristales de proteínas. Las ventajas de la tecnología de gotas en suspensión comprende el hecho de que las sustancias que se están investigando están completamente rodeadas de medio nutritivo que proporciona todos los factores necesarios, tales como iones, factores de diferenciación, sustancias tóxicas etc. Además, se promueve la agregación de células (por ejemplo células madre) ya que las células se hunden hacia el ápice de la gota donde confluyen y forman un agregado (por ejemplo, cuerpos embrionarios) sin haberse puesto en contacto con ninguna superficie sólida. La tensión superficial de la gota impide que las células, así como los agregados celulares, penetren en la superficie de la gota. Sin embargo, las gotas aplicadas con una pipeta pueden comprender solo un pequeño volumen ya que las gotas pueden desplazarse sobre la superficie durante la inversión de la superficie para proporcionar la posición correcta para establecer las gotas en suspensión. Para proporcionar gotas más grandes del mismo tamaño y por tanto permitir idénticos medios de cultivo o de reacción, se proponen estructuras en relieve con aristas bien definidas que limitan un área de contacto de gota sobre una superficie particular.

Más recientemente (véase, por ejemplo, Kelm y col. 2004 o Khademhosseini y col. 2006, PNAS Vol. 103, No. 8: 2480-2487) , al cultivo celular en gotas en suspensión se le había denominado ingeniería tisular a microescala usando ensamblajes celulares forzados por gravedad. Por lo cual Khademhosseini y col. parecieron preferir la ingeniería tisular a microescala usando ensamblajes celulares basados en moldes en micropocillos de polietilenglicol (PEG) ; Kelm y Fussenegger aplicaron la técnica de gotas en suspensión en pocillos de una placa multipocillo o Terasaki.

Todos estos documentos informan sobre la necesidad de invertir el sustrato en el cual se adhieren las gotas para habilitarlas correctamente como gotas en suspensión. Después de invertirse, se informa que los sustratos se encuentran en posición horizontal o incluyen un ángulo de al menos 90º con la dirección horizontal (véase el documento WO 03/078700 A1) . Dicha inversión es difícil de realizar manualmente e incluso es más difícil que la realice un robot. Por tanto, la inversión de la placa, que requiere que se realice manualmente, hace que no sea posible compatibilizar la producción en masa y la automatización. Es por lo tanto un objetivo de la presente invención proporcionar una placa para gotas en suspensión que haga que no sea necesaria la inversión del sustrato

en el cual se adhieren las gotas. Otro objetivo de la presente invención es la posibilidad de realizar cambios de medio de manera repetitiva con un riesgo mínimo de aspiración y/o pérdida de microtejidos.

El documento WO 2008/123741 A1 desvela una placa de cultivo celular para la formación de cuerpos embrionarios a partir de células madre embrionarias en surcos en los extremos inferiores de varillas de soporte unidas a la parte inferior de una tapa cobertora que se coloca sobre una placa de cultivo. La configuración está destinada a las gotas en suspensión que, sin embargo, tienen que aplicarse desde abajo hacia los extremos inferiores de las varillas de soporte.

El documento US 2003/0235519 A1 desvela una tapa que cubre los pocillos en una microplaca y está destinada para aplicar gotas en suspensión en el lado inferior de la tapa. La configuración permite cargar el líquido desde arriba mediante algún tipo de canales microfluidos incorporados en la tapa. Sin embargo, dichos canales no están definidos con exactitud y por tanto no permiten controlar con precisión la etapa de carga del líquido.

Por consiguiente, es otro objetivo de la presente invención proporcionar una placa para gotas en suspensión mejorada que permita, de manera muy reproducible y fácil, manipular la carga del líquido de gota desde arriba.

Estos objetivos se consiguen con una placa para gotas en suspensión de acuerdo con los aspectos de la reivindicación 1 independiente. Esta placa para gotas en suspensión, como se propone al principio y de acuerdo con la presente invención, se caracteriza porque el cuerpo comprende adicionalmente al menos un conducto que desemboca dentro de al menos un área de contacto de gota desde la dirección de la primera superficie del cuerpo comprendiendo el conducto un compartimento de cultivo que se sitúa cerca de la segunda superficie del cuerpo y que comprende al menos una parte del área de contacto de gota. Adicionalmente la invención y aspectos preferidos derivan de las reivindicaciones dependientes.

De acuerdo con una realización de la placa para gotas en suspensión, el conducto penetra parcialmente en el cuerpo en una dirección esencialmente perpendicular en la región de al menos un área de contacto de gota y de manera esencial, se extiende parcialmente en paralelo a la segunda superficie. En una realización, el conducto comprende una conexión de entrada que se sitúa en un lado frontal del cuerpo. En otra realización, el conducto penetra además en la primera... [Seguir leyendo]

1. Placa para gotas en suspensión (1) , que comprende un cuerpo (2) con una primera superficie (3) y una segunda superficie (4) que es esencialmente coplanaria a la primera superficie (3) y que comprende al menos un área de contacto de gota (5) para recibir de manera adherente un volumen líquido (6) para cultivar células o para producir agregados moleculares en su interior, diferenciándose la por lo menos un área de contacto de gota (5) de un área circundante (7) por una estructura en relieve (8) o un revestimiento hidrófobo selectivo (21) que impide la dispersión del volumen líquido (6) sobre la segunda superficie (4) del cuerpo (2) , caracterizada porque el cuerpo (2) comprende adicionalmente al menos un conducto (9) que desemboca en la por lo menos un área de contacto de gota (5) desde la dirección de la primera superficie (3) del cuerpo (2) , comprendiendo el conducto (9) un compartimento de cultivo (13) que está situado cerca de la segunda superficie (3) del cuerpo (2) y que comprende al menos una parte del área de contacto de gota (5) .

2. Placa para gotas en suspensión (1) de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque el compartimento de cultivo (17) tiene una forma seleccionada del grupo que consiste en una forma cilíndrica, cónica e hiperbólica.

3. Placa para gotas en suspensión (1) de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque el compartimento de cultivo (17) es una depresión en forma de embudo con paredes rectas o curvadas, comprendiendo el conducto

(9) un compartimento de entrada (12) que se sitúa cerca de la primera superficie (3) del cuerpo (2) , realizándose el compartimento de entrada (12) como una parte ensanchada (13) del conducto (9) dentro del cuerpo (2) , como una taza (14) sobre la primera superficie (3) del cuerpo (2) , o como una combinación de una parte ensanchada (13) tal y una taza (14) .

4. Placa para gotas en suspensión (1) de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el compartimento de cultivo (17) tiene un volumen de entre 10 y 100 μl, preferentemente de entre 10 y 50 μl.

5. Placa para gotas en suspensión (1) de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el conducto (9) tiene una forma cilíndrica/frustocónica o hiperbólica.

6. Placa para gotas en suspensión (1) de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque el conducto (9) comprende una parte capilar (18) con un diámetro de entre 10 μm y 500 μm, preferentemente de entre 50 μm y 200 μm.

7. Placa para gota en suspensión (1) de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada porque la parte capilar (18) cilíndrica o hiperbólica del conducto (9) tiene una longitud de entre 0, 1 mm y 30 mm, preferentemente de entre 0, 5 mm y 2 mm.

8. Placa para gotas en suspensión (1) de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque tiene una estructura en relieve (8) que se selecciona de un grupo que comprende un reborde, una protuberancia, una depresión, una elevación y cualquier combinación de las mismas y se localiza en o sobre la segunda superficie (4) .

9. Placa para gotas en suspensión (1) de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el conducto (9) penetra en todo el cuerpo (2) en una dirección esencialmente perpendicular desde la primera superficie (3) a la segunda superficie (4) .

10. Placa para gotas en suspensión (1) de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el conducto (9) se realiza como un canal no ramificado que esencialmente se extiende perpendicularmente hacia la primera y segunda superficies (3, 4) , en el que todas las partes del conducto (9) están alineadas coaxialmente.

11. Placa para gotas en suspensión (1) de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque el conducto (9) se realiza como un canal ramificado que comprende partes de canal (19) que esencialmente se extienden perpendicularmente hacia la primera y segunda superficies (3, 4) y partes ramificadas (20) que esencialmente se extienden paralelas a la segunda superficie (4) .

12. Placa para gotas en suspensión (1) de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el área de contacto de gota (5) se reviste selectivamente con un revestimiento hidrófilo.

13. Placa para gotas en suspensión (1) de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque el área de contacto de gota (5) se reviste selectivamente con compuestos biológicamente activos que se seleccionan de un grupo que comprende polipéptidos y polinucleótidos.

14. Placa para gotas en suspensión (1) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque al menos esencialmente tiene la forma de una microplaca convencional y porque las áreas de contacto de gota (5) se disponen en una matriz, preferentemente de 4 x 6, de 8 x 12 o de 16 x 24 áreas de contacto de gota (5) .

15. Procedimiento de cultivo de células o de producción de agregados moleculares en al menos un volumen líquido

(6) que se adhiere a un área de contacto de gota (5) de una placa para gotas en suspensión (1) de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque un volumen líquido (6) se aplica a un área de contacto de gota (5) a través de un conducto (9) que desemboca en el área de contacto de gota (5) desde la dirección de la primera superficie (3)

del cuerpo (2) .

16. Procedimiento de cultivo de células de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque varias células o micro-agregados celulares de al menos un tipo de célula se

- suspenden en un líquido,

- desplazan a través de un conducto (9) de la placa para gotas en suspensión (1) junto con un volumen líquido 10 (6) ,

- cultivan dentro del volumen líquido (6) ; y

se forma un microtejido dentro del volumen líquido (6) a partir de las células cultivadas.

17. Procedimiento de cultivo de células de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque varias células o micro-agregados celulares de al menos un tipo de célula se - desplazan a través de un conducto (9) de la placa para gotas en suspensión (1) hasta un volumen líquido (6) ,

- cultivan dentro del volumen líquido (6) ; y

se forma un microtejido dentro del volumen líquido (6) a partir de las células cultivadas.

18. Procedimiento de cultivo de células o de producción de agregados moleculares de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque una parte del líquido del volumen líquido (6) se extrae a través del conducto (9) respectivo de la placa para gotas en suspensión (1) que está asignada al área de contacto de gota (5) .

19. Procedimiento de cultivo de células o de producción de agregados moleculares de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado porque al menos una parte del líquido extraído se reemplaza por un líquido que se suministra a través del conducto (9) respectivo de la placa para gotas en suspensión (1) que está asignada al área de contacto de gota (5) .

20. Uso de la placa para gotas en suspensión (1) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en la exploración de sistemas farmacológicos o en ensayos de toxicidad basados en células o en producción en masa de re-agregados celulares o cristales de proteínas.