Par de cebadores para la detección de un gen (VIP3A) que codifica un insecticida.

Un par de cebadores para detectar la presencia de ácidos nucleicos específicos para el suceso COT102 en unamuestra biológica,

comprendiendo el par de cebadores un primer cebador y un segundo cebador diseñados paraunirse a un polinucleótido que comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2cuando dicho polinucleótido es monocatenario, en el que el primer cebador y el segundo cebador, cuando se usanjuntos en una reacción de PCR, producen un amplicón que comprende al menos una secuencia de SEC ID NO: 1 oSEC ID NO: 2, y en el que la producción de un amplicón es indicativa de ácidos nucleicos específicos para el sucesoCOT102.

Par de cebadores para la detección de un gen (VIP3A) que codifica un insecticida La presente invención se refiere a pares de cebadores para detectar material derivado de una planta de algodón transgénica resistente a insectos.

Las plagas vegetales son un factor importante en la pérdida de las cosechas agrícolas importantes del mundo. Se pierden alrededor de 8 mil millones de dólares cada año en los Estados Unidos de América debido a infestaciones de plantas por plagas no mamíferas, incluyendo insectos. Además de las pérdidas en cosechas de campo, las plagas de insectos también son una carga para los cultivadores de vegetales y frutas, para productores de flores ornamentales, y para jardineros.

Las plagas de insectos se controlan principalmente mediante aplicaciones intensivas de plaguicidas químicos, que son activos mediante la inhibición del crecimiento de los insectos, prevención de la alimentación de reproducción de los insectos, o que provoca la muerte. De este modo se puede alcanzar un buen control de plagas de insectos, pero estos compuestos químicos pueden afectar también algunas veces a otros insectos beneficiosos. Otro problema que resulta del uso extendido de plaguicidas químicos es la aparición de variedades de insectos resistentes. Esto se ha aliviado parcialmente mediante diversas prácticas de manejo de la resistencia, pero hay una creciente necesidad de agentes de control de plagas alternativos. Los agentes de control de plagas biológicos, tales como las cepas de Bacillus thuringiensis que expresan toxinas plaguicidas como !-endotoxinas, también se han aplicado a plantas de cosechas con resultados satisfactorios, ofreciendo una alternativa o ayuda a plaguicidas químicos. Se han aislado los genes que codifican algunas de estas !-endotoxinas, y se ha demostrado que su expresión en hospedantes heterólogos proporciona otra herramienta para el control de plagas de insectos económicamente importantes. En particular, la expresión de toxinas insecticidas tales como !-endotoxinas de Bacillus thuringiensis en plantas transgénicas, ha proporcionado protección eficiente frente a plagas de insectos seleccionadas, y se han comercializado plantas transgénicas que expresan tales toxinas, permitiendo a los granjeros reducir las aplicaciones de agentes de control de insectos químicos.

Recientemente, se ha identificado una nueva familia de proteínas insecticidas producidas mediante Bacillus sp. durante las etapas vegetativas de crecimiento (proteínas insecticidas vegetativas (VIPs) ) . Las patentes U.S. 5.877.012, 6.107.279, y 6.137.033 describen genes de la toxina vip3A, aislados de la especie Bacillus. Las toxinas VIP3A poseen actividad insecticida frente a un amplio espectro de insectos lepidópteros, que incluye, pero no se limita a, gusano cogollero del maíz, Spodoptera frugiperda, gusano cortador grasiento, Agrotis ipsilon, taladrador de la caña de azúcar, Diatraea saccharalis, y gusano picador, Elasmopalpus lignosellus, y, cuando se expresan en plantas transgénicas, por ejemplo algodón, confieren protección a la planta del daño por ingestión del insecto.

La familia del algodón, género Gossypium, un miembro de las Malváceas, consiste en 39 especies, de las cuales Gossypium hirsutum es la especie más habitualmente cultivada. También se cultivan otras tres especies: G. arboreum, G. barbadense, y G. herbaceum. Estas especies cultivadas se hacen crecer principalmente para las masas de fibras sedosas que se convierten en telas. El algodón es adecuado como fibra textil debido a que las hebras secas maduras se retuercen de tal manera que se pueden hilar de ellas hebras fuertes finas. Otros productos, tales como aceite de semilla de algodón, torta, y removedoras de hilachas de algodón son subproductos de la producción de fibras.

El daño a las cosechas de algodón por plagas de insectos en todo el mundo da como resultado cada año una pérdida significativa de producción. El control eficaz de estas plagas para minimizar la pérdida de producción es de gran importancia económica. Los ejemplos de plagas de insectos de algodón incluyen rosquilla verde gardana (Spodoptera exigua) , picudo del algodonero (Anthonomus grandis grandis) , gusano medidor del repollo (Trichoplusia ni) , insecto de planta anubarrado (Neurocolpus nubilus) , áfido del algodón (Aphis gossypii) , gusano pelotero (Heliocoverpa zea) , gusanos cortadores (Feltia subterranea, Peridroma saucia, Agrotis ipsilon) , taladrador del maíz europeo (Ostrinia nubilalis) , cogollero del maíz (Spodoptera frugiperda) , trips de plántula (Frankliniella spp.) , falso medidor (Pseudoplusia includens) , insectos hediondos (Nezara viridula, Acrosternum hilare, Euschistus servus) , chinche opaca de las plantas (Lygus lineolaris) , perforador mayor de la bellota (Heliothis virescens) y moscas blancas (Trialeurodes abutilonea, Bemisia tabaci) .

La transformación y regeneración de plantas de algodón es ahora un procedimiento bien consolidado, basado típicamente en transferencia de ADN extraño mediada por Agrobacterium tumefaciens en partes vegetales de algodón y la regeneración de dichas partes vegetales en cultivo tisular en plantas de algodón transgénicas, completamente fértiles.

Existe la necesidad de generar una planta de algodón que sea resistente a insectos, de manera que se reduzca la pérdida de producción por daño a las cosechas de algodón por plagas de insectos. Una planta de algodón resistente a insectos podría reducir la necesidad de aplicar plaguicidas químicos, que pueden ser perjudiciales a otros insectos beneficiosos y al entorno.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a medios para detectar material vegetal derivado de un suceso de algodón transgénico resistente a insectos, denominado COT102. En particular, la presente invención se refiere a un par de cebadores para detectar la presencia de ácidos nucleicos específicos para el suceso COT102 en una muestra biológica, comprendiendo el par de cebadores un primer par y un segundo par diseñados para unirse a un polinucleótido que comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2 cuando dicho polinucleótido es monocatenario, en el que el primer cebador y el segundo cebador, cuando se usan juntos en una reacción de PCR, producen un amplicón que comprende al menos una secuencia de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2, y en el que la producción de un amplicón es indicativa de ácidos nucleicos específicos para el suceso COT102. Preferiblemente, el primer cebador se diseña para unirse a una secuencia de ADN específica para el sitio de inserción de COT102, y el segundo cebador se diseña para unirse a una secuencia de ADN genómico flanqueante en dirección 3’ del extremo 3’ del sitio de inserción de COT102, o a una secuencia de ADN genómico flanqueante en dirección 5’ del extremo 5’ del sitio de inserción de COT102, en el que el sitio de inserción de COT102 comprende la secuencia de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2. En una realización preferida, el primer cebador tiene la secuencia de SEC ID NO: 3, y el segundo cebador tiene la secuencia de SEC ID NO: 4. En una realización preferida adicional, el primer cebador tiene la secuencia de SEC ID NO: 19, y el segundo cebador tiene la secuencia de SEC ID NO: 18.

“Suceso COT102”, en el contexto de esta solicitud, se refiere a la planta de algodón transgénica insecticida original descrita aquí. “Insecticida”, como se usa aquí, se refiere a cualquier efecto inhibidor sobre un insecto, incluyendo, pero sin limitarse a, alimentación reducida, crecimiento retardado, fecundidad reducida, parálisis o muerte. “Fecundidad” comprende todos los aspectos relacionados con la reproducción, tales como la capacidad reproductora, la frecuencia reproductora y el número de descendientes.

El suceso COT102 muestra un genotipo nuevo que comprende dos casetes de expresión. El primer casete comprende un promotor adecuado para la expresión en plantas, operablemente enlazado a un gen que codifica una toxina insecticida VIP3A, útil para controlar un amplio espectro de plagas de insectos lepidópteros, y una señal de poliadenilación adecuada. Los promotores adecuados se pueden aislar, entre otros, de plantas. Se han aislado y caracterizado numerosos promotores vegetales, incluyendo promotores constitutivos, encendibles y/o específicos de tejidos. Los promotores adecuados se pueden se pueden seleccionar del siguiente grupo no limitante: CaMV35S, FMV35S, ubiquitina, Act2, NOS, OCS, el promotor del virus de la hoja rizada amarilla del Cestrum, patatina, E9, el conector alcA/alcR, el conector GST, el conector RMS, oleosina, gelvina, la subunidad pequeña de ribulosa bisfosfato carboxilasa-oxigenasa, actina 7, el promotor MR7 (maíz) , Gos... [Seguir leyendo]

1. Un par de cebadores para detectar la presencia de ácidos nucleicos específicos para el suceso COT102 en una muestra biológica, comprendiendo el par de cebadores un primer cebador y un segundo cebador diseñados para unirse a un polinucleótido que comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2

cuando dicho polinucleótido es monocatenario, en el que el primer cebador y el segundo cebador, cuando se usan juntos en una reacción de PCR, producen un amplicón que comprende al menos una secuencia de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2, y en el que la producción de un amplicón es indicativa de ácidos nucleicos específicos para el suceso COT102.

2. El par de cebadores según la reivindicación 1, en el que el primer cebador se diseña para unirse a una secuencia de ADN específica para el sitio de inserción de COT102, y el segundo cebador se diseña para unirse a una secuencia de ADN genómico flanqueante en dirección 3’ del extremo 3’ del sitio de inserción de COT102, o a una secuencia de ADN genómico flanqueante en dirección 5’ del extremo 5’ del sitio de inserción de COT102, en el que el sitio de inserción de COT102 comprende la secuencia de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2.

3. Un par de cebadores según la reivindicación 2, en el que el primer cebador tiene la secuencia de SEC ID NO: 3, y 15 el segundo cebador tiene la secuencia de SEC ID NO: 4.

4. Un par de cebadores según la reivindicación 2, en el que el primer cebador tiene la secuencia de SEC ID NO: 19, y el segundo cebador tiene la secuencia de SEC ID NO: 18.