Método y aparato para la tinción automatizada de materiales biológicos.

Un método para realizar un procedimiento de tinción para una muestra biológica,

comprendiendo el método:

grabar una primera imagen de la muestra;

aplicar un agente de tinción a la muestra de manera que se prepare una muestra teñida que comprender unapluralidad de entidades teñidas, incluyendo la pluralidad de entidades teñidas al menos una de una pluralidadde entidades teñidas y de una pluralidad de entidades teñidas superficialmente;

grabar una segunda imagen de la muestra teñida;

generar una primera imagen diferencial comparando la segunda imagen con la primera imagen de maneraque se determine una posición de al menos una de las entidades teñidas sobre la superficie;

aplicar un agente decolorante a la muestra teñida de manera que se prepare una muestra parciamentedecolorada en la que al menos una parte del agente de tinción ha sido retirado de las entidades teñidassuperficialmente;

grabar una tercera imagen de la muestra decolorada parcialmente;

generar una segunda imagen diferencial comparando la tercera imagen con la segunda imagen de maneraque se determine una posición de al menos una de las entidades teñidas superficialmente sobre la superficie;y

analizar la segunda imagen diferencial para determinar un tiempo de exposición durante el cual el agentedecolorante puede ser aplicado a la muestra decolorada parcialmente para decolorar sustancialmente lasentidades teñidas superficialmente sin decolorar sustancialmente las entidades teñidas;

y corregir la aplicación del agente de tinción y / o del agente decolorante en base al menos en parte en almenos una imagen diferencial.

Método y aparato para la tinción automatizada de materiales biológicos CAMPO DE LA INVENCION La invención presente trata de métodos y aparatos para la tinción de material biológico con el propósito de detectar e identificar microorganismos que causan enfermedades. Más en particular, la invención presente trata de métodos y aparatos para realizar la tinción Gram automatizada en portaobjetos de microscopios.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La tinción de Gram es uno de los procedimientos realizados con más frecuencia en los laboratorios de microbiología modernos. Tales procedimientos se utilizan ampliamente para clasificar las bacterias como “Gram positivas” o “Gram negativas”. Tras fijar una muestra que contiene bacterias en un portaobjetos de microscopio, la muestra se trata utilizando agentes de tinción como por ejemplo cristal de violeta en combinación con el yodado de Gram. El primer paso tiñe todas las bacterias de un azul oscuro o violeta. La diferencia principal entre las bacterias “Gram positivas”

o “Gram negativas” es que en las muestras “Gram positivas”, los agentes de tinción se absorben dentro de la estructura celular completamente, mientras que en las muestras “Gram negativas” la tinción ocurre únicamente superficialmente. En consecuencia, cuando la muestra es tratada a continuación con un agente decolorante (como por ejemplo alcohol ácido) , las bacterias Gram negativas tienden a perder su color, mientras que las bacterias Gram positivas continúan teñidas de azul o violeta.

La tinción Gram se prepara convencionalmente y se analiza manualmente. La tinción Gram manual es intensiva en mano de obra, requiere personal adiestrado, y puede fallar al conseguir unas características de tinción óptimas en la muestra preparada. Una tinción no óptima puede producir falsos Gram positivos así como falsos Gram negativos.

Ha habido diferentes intentos para automatizar el procedimiento de tinción Gram. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos número 4, 029, 470 de Wilkins et al. (“Wilkins”) . De manera similar, el Aerospray Slide Stainer, suministrado comercialmente por Wescor, Inc. de Logan, Utah, es un aparato para la tinción automatizada rudimentario. Otros dispositivos de tinción incluyen el Midas III Slide Stainer, suministrado comercialmente por Merck KGaA de Darmstadt, Alemania; el Poli Stainer, que es suministrado comercialmente por IUL Instruments GmbH de Koenigswinter, Alemania; y el Automated Gram Stainer, suministrado comercialmente por GG&B Company de Wichita Falls, Texas y descrito de manera general en el documento de Patente de los Estados Unidos número 6, 468, 764 de Gibbs et al. Ninguno de estos instrumentos o técnicas, sin embargo, permiten la capacidad de aplicar tinte y / o agentes decolorantes antes, durante y / o después del examen y / o del procesamiento de la imagen de la muestra en el portaobjetos.

En consecuencia, existe una necesidad para un método y un sistema de tinción automatizada mejorada.

SUMARIO DE LA INVENCION la invención presente, en varias realizaciones, proporciona un método y un sistema que soluciona muchos problemas técnicas en relación con la optimización de los procedimientos de tinción (como por ejemplo la tinción Gram) de muestras biológicas. El método de la invención comprende generar una imagen diferencial basada al menos en parte en una comparación de las imágenes de la muestra grabadas antes y después de la aplicación del agente de tinción y del agente decolorante a la muestra, y en la corrección de la aplicación del agente de tinción y del agente decolorante en base al menos en parte a la imagen diferencial. El método comprende además aplicar de nuevo al menos uno de los agentes de tinción y de so agentes decolorantes de acuerdo con el paso de corrección y generar una imagen final de la muestra de manera que se diferencia al menos un objeto de interés en la muestra que puede ser hallado discernible por el paso de reaplicación.

Algunas realizaciones proporcionan además un método para realizar un procedimiento de tinción de una muestra que comprende los pasos para grabar una primera imagen de la muestra y aplicar un agente de tinción a la muestra de manera que se prepare una muestra teñida que comprende una pluralidad de entidades teñidas. Algunas realizaciones del método comprenden además los pasos de lavar la muestra con una solución de limpieza antes de grabar la primera imagen de la muestra para asegurar que cada muestra es lavada para establecer un nivel “cero” de tinción antes de grabar la primera imagen (lo que proporciona una base de comparación con las imágenes grabadas de la muestra tras la aplicación de al menos uno de los agentes de tinción o de los agentes decolorantes) .

La pluralidad de entidades teñidas puede incluir al menos una de las pluralidades de entidades teñidas o de la pluralidad de entidades teñidas superficialmente. En algunas de tales realizaciones, el agente de tinción puede comprender un tinte Gram de manera que las entidades teñidas superficialmente, si están presentes, comprendan una pluralidad de entidades Gram negativas, de manera que las entidades teñidas, si están presentes, comprendan una pluralidad de entidades Gram positivas. El método puede comprender además grabar una segunda imagen de la muestra teñida y generar una primera imagen diferencial comparando la segunda imagen con la primera imagen de manera que se determine una posición de al menos una de las entidades teñidas en la superficie.

El método puede comprender además aplicar un agente decolorante a la muestra teñida de manera que se prepare una muestra parcialmente decolorada en la que al menos una parte del agente de tinción es eliminado de las entidades teñidas superficialmente, y grabar una tercera imagen de la muestra parcialmente decolorada. El método puede comprender también generar una segunda imagen diferencial comparando la tercera imagen con la segunda imagen de manera que se determine una posición de al menos una de las entidades teñidas superficialmente sobre la superficie. Finalmente, el método puede comprender analizar la segunda imagen diferencial para determinar un tiempo de exposición durante el cual el agente decolorante podría ser aplicado a la muestra parcialmente decolorada para decolorar sustancialmente las entidades teñidas superficialmente sin decolorar sustancialmente las entidades teñidas.

En algunas realizaciones, el método puede comprender también aplicar el agente decolorante a a muestra parcialmente decolorada para determinar el tiempo de exposición de manera que se prepare una muestra sustancialmente decolorada mientras las entidades teñidas superficialmente son decoloradas sustancialmente y en la que las entidades tintadas no son decoloradas sustancialmente. En algunas de dichas realizaciones, el método puede comprender además: (1) grabar una cuarta imagen de la muestra sustancialmente decolorada; (2) generar una tercera imagen diferencial comparando la cuarta con la segunda imagen, en el que la tercera imagen diferencial muestra la posición de al menos una de las entidades teñidas superficialmente en la superficie; y (3) generar una cuarta imagen diferencial comparando la cuarta imagen con la primera imagen, en el que la cuarta imagen diferencial muestra una posición de al menos una de las entidades teñidas sobre la superficie. En realizaciones del método en la que las posiciones de las entidades teñidas y de las entidades teñida superficialmente son discernibles al menos parcialmente en al menos una de la tercera o de la cuarta imagen diferencial, el método puede comprender también analizar una morfología de las entidades teñidas y / o de las entidades teñidas superficialmente.

El sistema de la invención presente comprende una cámara de flujo que define un canal en comunicación fluida con un suministro de un agente de tinción y un suministro de un agente decolorante. Además, en algunas de tales realizaciones, la cámara de flujo puede comprender una superficie configurada para engranar operativamente la muestra con ella. El sistema comprende también un sistema de fluidos en comunicación fluida con la cámara de flujo, el suministro de agente de tinción, y / o el suministro de agente decolorante. Además, el sistema de fluidos de la invención (en cooperación con la cámara de flujo, por ejemplo) está configurado para aplicar el agente de tinción a la muestra de manera que se prepare una mezcla teñida comprendiendo una pluralidad de entidades teñidas, en el que la pluralidad de entidades teñidas puede incluir al menos una de una pluralidad de entidades teñidas y de una pluralidad de entidades teñidas superficialmente.... [Seguir leyendo]

1. Un método para realizar un procedimiento de tinción para una muestra biológica, comprendiendo el método:

grabar una primera imagen de la muestra; aplicar un agente de tinción a la muestra de manera que se prepare una muestra teñida que comprender una pluralidad de entidades teñidas, incluyendo la pluralidad de entidades teñidas al menos una de una pluralidad de entidades teñidas y de una pluralidad de entidades teñidas superficialmente; grabar una segunda imagen de la muestra teñida; generar una primera imagen diferencial comparando la segunda imagen con la primera imagen de manera que se determine una posición de al menos una de las entidades teñidas sobre la superficie; aplicar un agente decolorante a la muestra teñida de manera que se prepare una muestra parciamente decolorada en la que al menos una parte del agente de tinción ha sido retirado de las entidades teñidas superficialmente; grabar una tercera imagen de la muestra decolorada parcialmente; generar una segunda imagen diferencial comparando la tercera imagen con la segunda imagen de manera que se determine una posición de al menos una de las entidades teñidas superficialmente sobre la superficie; y analizar la segunda imagen diferencial para determinar un tiempo de exposición durante el cual el agente decolorante puede ser aplicado a la muestra decolorada parcialmente para decolorar sustancialmente las entidades teñidas superficialmente sin decolorar sustancialmente las entidades teñidas; y corregir la aplicación del agente de tinción y / o del agente decolorante en base al menos en parte en al menos una imagen diferencial.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprender además aplicar el agente decolorante a la muestra parcialmente decolorada para el tiempo de exposición determinado de manera que se prepare una muestra sustancialmente decolorada en la que las entidades teñidas superficialmente estén sustancialmente decoloradas y en la que las entidades teñidas no estén sustancialmente decoloradas.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende además:

grabar una cuarta imagen de la muestra sustancialmente decolorada; generar una tercera imagen diferencial comparando la cuarta imagen con la segunda imagen, describiendo la tercera imagen diferencial la posición de al menos una de las entidades teñidas superficialmente sobre la superficie y generar una cuarta imagen diferencial comparando la cuarta imagen con la primera imagen, describiendo la cuarta imagen diferencial una posición de al menos una de las entidades teñidas sobre la superficie.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende además analizar una morfología de la menos una de las entidades teñidas superficialmente, o de las entidades teñidas.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el agente de tinción comprende un tinte Gram y en el que las entidades teñidas superficialmente comprenden una pluralidad de bacterias Gram negativas, y en el que las entidades teñidas comprenden una pluralidad de bacterias Gram positivas.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo además:

aplicar el agente de tinción y / o el agente decolorante de acuerdo con el paso de corrección; y generar una imagen final de la muestra de manera que se diferencie al menos un objeto de interés en la muestra que se convierta en discernible por la aplicar de nuevo del paso.

7. Un sistema para realizar un procedimiento de tinción de una muestra biológica, comprendiendo el método:

una cámara de flujo que define un canal en comunicación fluida con un suministro de agente de tinción y con un suministro de agente decolorante, comprendiendo la cámara de flujo una superficie configurada para relacionarse operativamente con la muestra que está en ella; un sistema de fluidos en comunicación fluida con la cámara de flujo, el suministro de agente de tinción, y el suministro del agente decolorante; el sistema de fluidos configurado para aplicar el agente de tinción a la muestra de manera que se prepare una muestra teñida que comprende una pluralidad de entidades teñidas y / o una pluralidad de entidades teñidas superficialmente; el sistema de fluido configurado demás para aplicar el agente decolorante a la muestra teñida de manera que se prepare una muestra parcialmente decolorada en la que al menos una parte del tinción es retirado de las entidades teñidas superficialmente; un sistema de imagen dispuesto adyacente a la cámara de flujo y configurado para grabar al menos una imagen de la muestra antes, durante, y / o tras la aplicación del agente de tinción y del agente decolorante,

estando configurado además el sistema de imagen para generar al menos una imagen diferencial basada al menos en parte en una comparación de imágenes de la muestra grabas antes y después de la aplicación del agente de tinción y tras la aplicación del agente decolorante a la muestra; y un dispositivo controlador en comunicación con el sistema de imagen y con el sistema de fluidos, estando configurado el dispositivo controlador para controlar la aplicación del agente de tinción y / o del agente decolorante en base al menos en parte en al menos una imagen diferencial.

8. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la cámara de flujo está adaptado para recibir un portaobjetos que define la superficie para relacionarse operativamente con la muestra que se encuentra en la misma y en la que la cámara de flujo comprende un alojamiento del canal de flujo que define una abertura del portaobjetos configurada para recibir el portaobjetos de manera que la muestra esté dispuesta sustancialmente entre el portaobjetos y el alojamiento del canal de flujo en el que se deposita el portaobjetos en la abertura del portaobjetos, comprendiendo el alojamiento del canal de flujo un material sustancialmente transparente de manera que el sistema de imagen es capaz de grabar la al menos una imagen de la muestra mientras la muestra está dispuesta entre el portaobjeto y el alojamiento del canal de flujo.

9. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el sistema de imagen comprende:

un dispositivo de cámara configurado para grabar la amenos una imagen de la muestra mientras la muestra está dispuesta entre el portaobjetos y el canal de la cámara de flujo; y un dispositivo actuador relacionado operativamente con el dispositivo de cámara y configurado para ajustar una posición del dispositivo de cámara en relación con la cámara de flujo.

10. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el sistema de imagen está configurado además par analizar la segunda imagen diferencial para determinar un tiempo de exposición durante el cual el agente decolorante puede ser aplicado a la muestra parcialmente decolorada para decolorar sustancialmente las entidades teñidas superficialmente, si están presentes, sin decolorar sustancialmente las entidades teñidas, si están presentes.

11. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 10, en el que los sistemas de fluidos están configurados además para cooperar con la cámara de flujo par aplicar el agente decolorante a la muestra parcialmente decolorada durante el tiempo de exposición determinado de manera que se prepare una muestra sustancialmente decolorada en la que las entidades teñidas superficialmente estén sustancialmente decoloradas, si están presentes, y en la que las entidades teñidas no estén sustancialmente decoloradas, si están presentes.

12. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el sistema de imagen comprende una computadora de procesamiento de imagen configurada para analizar la al menos una imagen diferencial y generar la al menos una imagen diferencial utilizando procedimientos seleccionado del grupo compuesto por:

sustracción de imagen;

adición de imagen;

cálculo del ratio de imagen; y

combinaciones de los mismos.

13. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el agente de tinción comprende un tinte Gram y en el que las entidades teñidas superficialmente comprende una pluralidad de bacterias Gram negativas, si están presentes, y en el que las entidades teñidas comprender una pluralidad de bacterias Gram positivas, si están presentes.