Método de determinación del origen genético de cérvidos.

Método de determinación del origen genético de cérvidos.

La presente invención pertenece al campo de la identificación genética de distintos cérvidos,

en particular se refiere a un método genético para determinar el origen genético de ciervos y gamos. Asimismo, se refiere a una serie de oligonucleótidos que permiten llevar a cabo dicho método genético y al kit que los comprende.

Método de determinación del origen genético de cérvidos

Campo de la invención La presente invención pertenece al campo de la identificación genética de distintos cérvidos, en particular se refiere a un método genético para determinar el origen genético de dos especies de cérvidos: ciervos y gamos. Asimismo, se refiere a los oligonucleótidos necesarios para llevar a cabo dicho método genético y a un kit que comprende dichos oligonucleótidos.

Antecedentes de la invención El concepto de trazabilidad genética surge, entre otros motivos, por la necesidad de conseguir una detección sensible y rápida del origen específico de la carne que se utiliza en la elaboración de alimentos humanos y animales, sobre todo cuando proceden de artiodáctilos. La trazabilidad genética es un tema de primordial importancia en el control de riesgo de contraer enfermedades de tipo neurodegenerativo tanto en el hombre como en especies animales, muestra de ello es que en los países desarrollados desde 1997 se prohíbe el uso de proteínas derivadas de rumiantes en la manufactura de alimentos para rumiantes. Además, la determinación del origen de la especie de carne es una parte integral del reglamento de control de los alimentos con respecto a la falsedad del valor económico de la misma. Por ejemplo, la carne de caza es a menudo objeto de etiquetado fraudulento, debido a los diferentes precios entre dicha carne de caza y otras especies de carne. Aparte de la posible pérdida económica, la correcta identificación de las especies cárnicas es importante para el consumidor por otras razones, tales como los requisitos médicos de las personas que pueden tener alergias alimentarias específicas o restricciones dietéticas religiosas. Para detectar estos fraudes y proteger a los consumidores, se han desarrollado herramientas fiables y sencillas que facilitan el control rutinario de toda la cadena alimentaria.

Los métodos convencionales utilizados en la identificación de especies, por ejemplo en productos cárnicos, han estado predominantemente basados en el análisis de proteínas mediante ensayos cromatográficos, electroforéticos o inmunoquímicos. Sin embargo, la mayoría de las proteínas sufren desnaturalización en productos calentados, resultando en cambios en la antigenicidad y movilidad electroforética de las moléculas, lo que puede afectar a los resultados de los análisis. Existen también métodos para la identificación de la carne basados en el análisis del ADN. En comparación con las técnicas basadas en proteínas, se ha demostrado que los métodos basados en el ADN son más fiables porque el ADN es más estable bajo las condiciones asociadas con altas temperaturas, presiones, y tratamientos químicos utilizados en la preparación de algunos productos alimenticios. En particular, la introducción de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en el análisis de alimentos ha proporcionado una amplia gama de técnicas para la detección e identificación rápida de organismos. Entre dichas técnicas, las más frecuentemente utilizadas son: (i)

amplificación por PCR con cebadores específicos de especie, que puede selectivamente detectar secuencias de ADN a partir de una mezcla de alimentos; y (ii) amplificación por PCR de un fragmento de uno o varios genes marcadores con cebadores universales, junto con técnicas como la secuenciación de nucleótidos o el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism) . Una reciente variante de esta última técnica (ii) es aquella en la que se amplifica por PCR un fragmento de ADN satélite (stADN) , que posteriormente se digiere con endonucleasas de restricción y los fragmentos obtenidos se resuelven mediante electroforesis. En el contexto de la presente invención, esta técnica se refiere como SFLP, por Satellite (Restriction) Fragment Length Polymorphism.

El ADN satélite está organizado en familias de genes (múltiples secuencias de ácido nucléico repetidas y de composición de nucleótidos similares) y está localizado principalmente en muchos de los centrómeros cromosómicos. Concretamente, en muchos artiodáctilos y específicamente en los cérvidos, el ADN satélite de tipo I (stADN I) está distribuido por todos sus autosomas y se caracteriza por estar compuesto de miles de copias de variabilidad genética aún poco conocida pero supuestamente abundante en perfiles genéticos específicos de especie. En la actualidad se considera que las técnicas de secuenciación y/o de clonación son más difíciles y/o tediosas cuando el gen objetivo consiste en familias de genes de copias múltiples muy similares en secuencia de nucleótidos, como es el caso de los genes del ADN satélite de los eucariotas. Sin embargo, la utilización de stADN presenta ventajas respecto a la utilización de genes heredados monoparentalmente, como son los genes mitocondriales, y los genes ligados al cromosoma Y. En los casos en que se producen especímenes híbridos entre especies o subespecies, lo cual no es poco común, se invalida cualquier test basado en genes heredados monoparentalmente. Además, los genes mitocondriales tienen en su contra las fuertes divergencias intra-específicas de sus secuencias.

La creciente tendencia hacia la reducción del contenido de grasa en la dieta ha aumentado el interés en el consumo de carnes de caza. Particularmente, el venado es cada vez más y más popular en los mercados europeos, siendo el ciervo (Cervus elaphus) y gamo (Dama dama) , las dos principales especies que exigen los consumidores. Sin embargo, hasta el momento, los métodos utilizados para identificar estas especies se basan en el análisis de fragmentos conservados de los genes mitocondriales 12S rADN con los inconvenientes anteriormente mencionados que ello conlleva. Por lo tanto, sigue existiendo en el estado de la técnica la necesidad de disponer de un método genético para discriminar dos especies de cérvidos estrechamente relacionadas, especialmente si son producto de mezclas inter-específicos. A este respecto, los autores de la presente invención describen un método genético que permite discriminar categóricamente dos especies de cérvidos estrechamente relacionadas, incluidos los productos de mezclas inter-específicas, de manera fiable, sencilla y económica.

Objeto de la invención La presente invención se refiere en un primer aspecto a un oligonucleótido (también referido como cebador) que comprende la secuencia SEQ ID NO 1 o la secuencia SEQ ID NO 2.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una pareja de cebadores donde un oligonucleótido comprende la secuencia SEQ ID NO 1 y otro comprende la secuencia SEQ ID NO 2.

La presente invención se refiere en un tercer aspecto al uso de una pareja de cebadores donde uno comprende la secuencia SEQ ID NO 1 y otro comprende la secuencia SEQ ID NO 2, para determinar el origen genético de las especies Cervus elaphus y Dama dama.

La presente invención se refiere en un cuarto aspecto a un método para determinar el origen genético de un cérvido que comprende las siguientes etapas:

a) Amplificación por PCR de un segmento de ADN satélite de tipo I a partir de ADN genómico de una muestra de cérvido con una pareja de cebadores donde un oligonucleótido comprende la secuencia SEQ ID NO 1 y otro comprende la secuencia SEQ ID NO 2,

b) Digestión enzimática del producto obtenido en la etapa a) con un enzima de restricción seleccionado del grupo formado por AluI, XspI y sus isoesquizómeros, y

c) Análisis del tamaño de los fragmentos resultantes de la digestión realizada en la etapa b) .

En un último y quinto aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende una pareja de cebadores donde un oligonucleótido comprende la secuencia SEQ ID NO 1 y otro la secuencia SEQ ID NO 2, marcados con un fluoróforo (uno de los oligonucleótidos o ambos simultáneamente) o sin marcar, para determinar el origen genético de las especies Cervus elaphus y Dama dama.

Breve descripción de las figuras Figura 1. Fotografía de un gel de agarosa obtenido tras la separación de fragmentos AluI por electroforesis submarina en agarosa al 2% y teñido con bromuro de etidio. En los carriles se muestran, de izquierda a derecha: marcador de peso molecular de fragmentos espaciados a 50bp (MW) , fragmento del producto de PCR sin digerir (PCR sin digerir) , producto de PCR obtenido a partir de ADN genómico de ciervo digerido con AluI (Ciervo/AluI) y producto de PCR obtenido a partir de stADN de gamo digerido con AluI (Gamo/AluI) . Las flechas señalan las bandas de aproximadamente 170 y 100 bp de ciervo y las bandas de aproximadamente 200 y 70 bp de gamo.

Figura 2. Espectroferograma que muestra los fragmentos identificados...

1. Oligonucleótido que comprende la SEQ ID NO 1 o la SEQ ID NO 2.

2. Oligonucleótido según la reivindicación 1 cuya secuencia es la SEQ ID NO 1 o la SEQ ID NO 2.

3. Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, marcado con un fluorocromo.

4. Pareja de cebadores que comprende un oligonucleótido de secuencia SEQ ID NO 1 y otro de secuencia SEQ ID NO 2 de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3.

5. Uso del oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de la pareja de cebadores según la reivindicación 4 para determinar del origen genético de las especies Cervus elaphus y Dama dama.

6. Método para determinar el origen genético de un cérvido que comprende las siguientes etapas: a) Amplificación por PCR de un segmento de ADN satélite de tipo I a partir de ADN genómico de una muestra de cérvido con una pareja de cebadores según la reivindicación 4, b) Digestión enzimática del producto obtenido en la etapa a) con un enzima de restricción seleccionado

del grupo formado por AluI, XspI y sus isoesquizómeros, y c) Análisis del tamaño de los fragmentos resultantes de la etapa b) .

7. Método según la reivindicación 6 donde el cérvido se selecciona del grupo formado por todos los miembro de la especie Cervus elaphus y todos los miembros de la especie Dama dama.

8. Método según la reivindicación 6 ó 7 en el que la etapa b) se lleva a cabo con el enzima de restricción AluI.

9. Método según la reivindicación 6 ó 7 en el que la etapa b) se lleva a cabo con el enzima de restricción XspI.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 en el que la etapa c) se lleva a cabo mediante electroforesis en gel de agarosa.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 en el que la etapa c) se lleva a cabo mediante electroforesis capilar.

12. Kit que comprende una pareja de cebadores según la reivindicación 4, para determinar el origen genético de las especies Cervus elaphus y Dama dama.

FIG.1

FIG. 2

FIG. 3

FIG. 4